Биохимические свойства:

ГОУ ВПО Кировская ГМА Росздрава

Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ДЛЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ

Практическое занятие № 5 по частной микробиологии

для студентов 3 курса

лечебного, педиатрического факультетов

ТЕМА: Возбудители холеры. Синегнойная палочка. Протей.

ЦЕЛЬ: способствовать формированию умений по изучению основных свойств холерных вибрионов, их роли в патологии, по проведению микробиологической диагностики заболевания, лечения и профилактики; ознакомиться с характеристикой синегнойной палочки и протея, их участием в возникновении гнойно-воспалительных заболеваний, внутрибольничных инфекций, пищевых отравлений.

ЗАДАЧИ:

· Рассмотреть биологические свойства холерных вибрионов, синегнойной палочки, протея;

· Изучить эпидемиологию, патогенез, особенности клинического течения холеры, гнойно-воспалительных заболеваний, пищевых отравлений;

· Обучить методам лабораторной диагностики холеры, синегнойной и протейной инфекции;

· Усвоить специфическую профилактику и лечение холеры, заболеваний, вызываемых синегнойной палочкой и протеем.

Студент должен знать:

1. До изучения темы (базисные знания): особенности метаболизма аэробных бактерий, строение и функции жгутиков, классификацию и характеристику питательных сред, роль pH среды в культивировании бактерий.

2. После изучения темы: биологические свойства холерных вибрионов, синегнойной палочки, протея; эпидемиологию и патогенез холеры, синегнойной и протейной инфекции; профилактику и лечение, микробиологическую диагностику указанных заболеваний.

Студент должен уметь:

· отбирать материал для бактериологического исследования;

· осуществлять посев на питательные среды;

· микроскопировать фиксированные препараты;

· проводить профилактику и лечение холеры синегнойной и протейной инфекций.

Контрольные вопросы:

· Какие биовары и серовары холерных вибрионов вы знаете?

· Укажите время выдачи предварительного и окончательного ответа о наличии холерного вибриона в исследуемом материале.

· Какой характер движения вибрионов?

· Что означают препараты «висячая» и «раздавленная» капля?

· Чем отличаются НАГ вибрионы?

· Укажите особенности синегнойной и протейной инфекций на современном этапе.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

План практического занятия (135 мин)

1. Организационные вопросы ………………………………………... 5 мин

2. Теоретическая часть ………………………………………………. 45 мин

3. Практическая работа ……………………………………………….40 мин

4. Изучение демонстрационного материала …………………………10 мин

5. Оформление протокола …………………………………………….. 5 мин

6. Обсуждение задания на следующее занятие………………………..5 мин

7. Время на перерыв……………………………………………………10 мин

8. Проверка протоколов и подведение итогов………………………..10 мин

9. Уборка рабочего места………………………………………………. 5 мин

Содержание занятия:

1. Контроль исходного уровня знаний.

Способ – программированный тест-контроль.

2. Ориентировочные основы самостоятельной работы студентов:

· выполнение практической работы;

· разбор демонстрационного материала;

· оформление и защита протокола по занятию.

Разделы:

1.Биологические свойства возбудителя холеры.

2.Эпидемиология, патогенез, клиника, иммунитет, диагностика, специфическая профилактика и лечение холеры.

3. Биологические свойства синегнойной палочки, особенности эпидемиологии, роли в патологии, микробиологической диагностики, специфической профилактики и лечения синегнойных инфекций.

4. Характеристика бактерий рода Proteus, их значение в возникновении острых кишечных инфекций, гнойно-воспалительных заболеваний, пищевых отравлений и внутрибольничных инфекций.

5. Практическая работа.

Тезисы основного материала:

1. Возбудители холеры.

Холера – это острое инфекционное заболевание с тенденцией к эпидемическому и пандемическому распространению, протекающее по типу острого гастроэнтерита с резким нарушением водно-солевого и белкового обмена, сопровождающееся обезвоживанием и тяжелой интоксикацией.

1.1. История открытия:

Распространение холеры:

1 период: до 1817 года – заболеваемость холерой не выходила за пределы Индии с эпицентром в дельте рек Ганг и Брахмапутра;

2 период: 1817-1926 годы – с развитием торговли холера проникает за пределы Индии на другие страны и континенты, вызывая 6 пандемий. В России с 1823 по 1926 годы переболело 5,6 млн. человек, из них погибли более 2 млн. (около 40%).

3 период – с 1926 по 1961 годы, отмечается снижение заболеваемости холерой во всем мире.

4 период – 1961 год по настоящее время – 7 пандемия холеры,

особенности:

· берет свое начало не из Индии, а из Индонезии;

· распространяется в две волны: 1- до 1991 года (Индонезия); 2 – с 1991 года – охватывая страны Южной и Северной Америки, особенно США;

· высокая скорость распространения;

· более продолжительна;

· смена биовара V. choleras asiaticae . V. eltor;

· высокий процент формирования вибрионосительства;

· течение болезни в виде стертых, атипичных форм.

В 1854 году Ф. Пацини обнаружил возбудителя в испражнениях больных, в 1883 году Р. Кохом выделен в чистом виде и изучены биологические свойства классического холерного вибриона, в 1906 году супруги Готшлих открывают биовар V. eltor на карантинной станции Эльтор; в 1993 году во время вспышки холеры в нововосточной Азии обнаружили вибрион серовара 0139 (Бенгал).

Таксономия:

Семейство Vibrionaceae

Род Vibrio

Вид V. cholerae

Биовары; V. cholerae asiaticae (classicae)

V. eltor

Морфология: слегка изогнутая палочка, размеры 1,5 -4,0х 0,2-0,4 мкм, полиморфна (от зернистых форм до палочковидных в зависимости от возраста культуры и исследуемого материала), монотрих (жгутик в 2-3 раза длиннее тела, повышенная подвижность, напоминает ундулирующую мембрану). При лечении антибиотиками подвижность уменьшается и может превращаться в L- формы. Спор и капсул не образует.

Тинкториальные свойства: легко окрашивается анилиновыми красителями, гр. « отрицательные», в нативных препаратах виде «стайки рыб».

Культуральные свойства:

· хорошо растет на обычных питательных средах, но требователен к p H (галофил), оптимальная p H = 8,0-9,0. В 1% щелочной пептонной воде через 6-8 часов отмечается рост в виде нежной, тонкой, голубоватой пленки, в 0,5 -1% Na Cl – легкая мутность; на плотной среде через 10-12 часов вырастают гладкие, прозрачные, голубоватые колонии с ровным краем (S формы), при длительном культивировании колонии увеличиваются в размерах, возможны атипичные колонии: мутные, с плотным центром, пигментированные (коричневого или желтого цвета), мелкие, шероховатые (R-формы), бактерии из них не чувствительны к бактериофагам, антибиотикам и не агглютинируются О-антисывороткой. На щелочно-кровяном агоре V. cholerae asiatica не дает зон гемолиза, V. eltor - дает зону гемолиза; на агаре с тиосульфатом, цитратом, солями желчных кислот и сахарозой (ТС BS агар) образует желтые колонии

· строгий аэроб;

· оптимальная температура роста 37 °С;

· время культивирования (6-8-10-12-24 часа).

Биохимические свойства:

активны, расщепляют глюкозу, мальтозу, лактозу, гликоген, маннит с образованием кислоты без газа, разжижают желатин в виде воронки, образуют индол, восстанавливают нитраты в нитриты (нитрозоиндоловая проба), разлагают мочевину, крахмал. По способности ферментировать сахарозу, арабинозу и маннозу все вибрионы по классификации Хейберга разделены на 6 групп. Холерные вибрионы принадлежат к 1 группе (триада Хейберга) – расщепляют сахарозу и маннозу и не расщепляют арабинозу.

Антигенная структура:

О-антиген – специфический, неоднороден: видовые и типовые антигены. В роду Vibrio 139 сероваров по О антигену. Вид определяется в реакции с 01 сывороткой, а тип с сыворотками Инаба и Огава, так как выделяют три серотипа: А, В, С; А – общий, АВ – Огава, АС – Инаба, АВС – Гикошима. Они являются эпидемиологическими маркерами.

Вибрионы, агглютинирующиеся сывороткой 0139, назвали биоваром Бенгал.

Rформы, слизистые М-формы с измененной структурой О-антигена не агглютинируются 01 антисывороткой, поэтому для идентификации OR и R диссоциантов используют OR- антисыворотки.

Н –антиген термолабильный, общий, неспецифической, белковой природы. Н- антигены общие для большой группы бактерий, их разделяют на А и В группы: А – холерный вибрион, В – холероподобные, 6 групп.

Вибрионы, не агглютинирующиеся сыворотками групп 01, называются неагглютинируемыми – НАГ вибрионами, вызывают холероподобные заболевания.

Также у холерного вибриона было выделено еще 2 антигена, которые стимулируют образование вибриоцидных и антитоксических антител.

Факторы патогенности:

1. токсины:

А) эндотоксин (ЛПС клеточной стенки, термостабильный, вызывает воспаление и индуцирует синтез вибриоцидных антител)

Б) экзотоксин= энтеротоксин= холероген (основная роль в патогенезе, термолабильный белок, его образование кодируют хромосомные и плазмидные гены, состоит из двух компонентов: А и В. Компонент А составляют субъединица А₁ (активный центр) и субъединица А₂ , связывающая А и В. Субъединица А₁ активирует аденилатциклазу, приводя к увеличению внутриклеточного содержания цАМф и выходу жидкости и электролитов из клеток либеркюновых желез в просвет кишечника.

Компонент В – нетоксичный, обладает способностью соединяться с рецепторами эпителиальных клеток тонкого кишечника, облегчая проникновение в клетку компонента А.

Бактерии серовара 0139 также синтезируют экзотоксин с аналогичными свойствами, но в меньших количествах.

В) экзотоксины LT, ST, SLT

Г) фактор проницаемости – повышает проницаемость капилляров.

2. ферменты: нейраминидаза= сиалидаза (отщепляет от гликопротеинов эпителия сиаловую кислоту, создавая «посадочную» площадку для вибрионов, увеличивая количество рецепторов для холерогена путем модификации три - и дисиалогликозидов в моносиалогликозиды

Gm₁); гиалуронидаза; муциназа (способствует разрушению муцина на эпителиальных клетках, что облегчает всасывание токсических продуктов), протеазы, лецитиназа, гемолизин V . eltor .

2. Структурные и химические компоненты клетки:

a) Жгутики, обусловливающие хемотаксисдля преодоления слизистого слоя и взаимодействие с эпителиальными клетками. У мутантов Сhe^– - (утративших способность к хемотаксису) вирулентность снижена, а у мутантов Mot^- – (утративших подвижность)вирулентность исчезает или снижается в 100-1000 раз.

Резистентность:

Выживаемость во внешней среде зависит от pH среды, вибрионы чувствительны к действию прямых солнечных лучей, высокой температуре (при 50° С погибают за 30 минут, 80° С – 5 минут, 100°С – через несколько секунд), высушиванию, в открытых водоемах сохраняются от нескольких дней до 2-3 недель- 3 месяцев, в морской воде до 47 суток, в почве от 8 дней до 3 месяцев, в сточных водах -1-2 суток, в выгребных ямах – до 3-4 месяцев. Устойчивы к действию низких температур (во льду могут сохраняться до 1-4 месяцев), сохраняются в молоке и молочных продуктах от 5 дней до 4 недель, на фруктах 1-2 дней, на сырых овощах -2-4 дня, в растворе сулемы1:100000 погибают через 5 минут, в хлорсодержащих веществах -10 минут; высокочувствительны к кислотам, к МnO₄ – 15 минут, чувствительны к антагонистическому действию сапрофитов, к антибиотикам тетрациклинового ряда, V . eltor устойчив к полимиксину в отличие от V. cholerae asiaticae /

Установлено наличие 7 наборов бактериофагов, среди V. cholerae выделяют 16 фаготипов. ХДФ -3 избирательно лизирует холерные вибрионы классического типа, ХДФ-4 – вибрионы Эль- Тор, ХДФ- 5 лизирует только холерогенные (вирулентные) вибрионы обоих типов.

Дифференциальные признаки возбудителей холеры

№ п/п	Признаки	V. cholerae Биовар asiaticae	V. cholerae Биовар eltor	Серовар 0139 (Бенгал)
1.	Реакция Фогес – Проскауэра	+ - (чаще -)	+ - (чаще +)	+ - (чаще +)
2.	Чувствительность к полимиксину В (50 ЕД)	+	-	-
3.	Чувствительность к классическому монофагу (С или 4 группа по С. Мукерджи)	+	-	-
4.	Чувствительность к монофагу 5 группы Эль- Тор	-	+	-
5.	Гемолиз эритроцитов барана	-	+	-
6.	Агглютинация куриных эритроцитов	-	+	+
7.	Гексаминовый тест (культуру выращ. в б-не с глюкозой, гексамином (уротропином) и индикатором бромтимоловым синим ( + - через 6-8 часов зеленый цвет изменен на желтый)	-	+	-
8.	Агглютинация с О сыв.	+	+	+
	О1	+	+	-
	Огава Инаба	+	+	?

Роль в патологии: вызывают холеру.

Эпидемиология:

Холера –антропонозное заболевание.

Источник инфекции – больной человек с первых дней заболевания, выделяет 100 млн.- 1 млрд. в 1 грамм кала. ДI = 1 млн. возбудителей; рековалесцей (в течение 7-10 дней); вибрионоситель (100- 100000 вибрионов 1 мл материала)

Механизм заражения: фекально-оральный, контактный.

Пути заражения: водный, алиментарный, контактно-бытовой,

Факторы передачи: вода, предметы окружающей среды, мухи (необходимо отметить, что в застойной воде, загрязненной органическими веществами, моющими средствами, холерный вибрион размножается; в экосистемах может существовать в виде некультивируемых форм, поэтому определяют ДНК-вибриона в полимеразой цепной реакции).

Патогенез: входные ворота – тонкий кишечник, основная роль принадлежит токсинам, особенно холерогену, вызывающему дегидратацию и обессоливание организма (адсорбируясь на рецепторах, активирует аденилатциклазу, что приводит к накоплению цАМФ, который усиливает секрецию электролитов Na⁺, HCO^-₃ , К⁺ , Cl ^– и воды из энтероцитов). Вибрион находится только в тонком кишечнике, размножается, не распространяясь по организму, вибрионемия отсутствует.

Клиника: инкубационный период от нескольких часов до 2-6 дней, чаще 2-3 дня. Выделяют 3 периода:

I. Холерный энтерит: на фоне нормальной температуры редкий жидкий стул, через 1-2 дня присоединяется рвота;

II. Острый гастроэнтерит: частая рвота, урчание в животе, испражнения приобретают вид «рисового отвара»- мутная жидкость с плавающими остатками слизи и клетками эпителия; акты дефекации учащаются, язык покрывается налетом, количество мочи уменьшается, выраженная жажда, обезвоживание;

III. Холерный алгид – t 35°C, кожные покровы серые, синюшные, морщинистые, лицо Гиппократа «facies hippocratica»: нос заострен, глаза запавшие, выступающие скулы; афония, гипотония. Смерть наступает от сердечно-сосудистой и почечной недостаточности в результате обезвоживания и интоксикации.

Иммунитет:постинфекционный, стойкий, продолжительный, антимикробный и антитоксический; поствакцинальный недлительный в течение 3 -5 месяцев.