Культуральные свойства

Рост. Bacillus anthracis хорошо растет на обычных питательных средах: бактерии можно даже выращивать на сыром или вареном картофеле, настое соломы, экстрактах злаков и бобовых. Температурный оптимум на агаре 35-36°С, на бульоне 32-33°С, оптимум рН 7,0. На жидких средах растет в виде ватных хлопьев, взвешенных комков, не вызывает помутнения среды. Дает характерный рост при посеве уколом в желатин («перевернутая елочка»); позднее верхний слой желатина разжижается, образуя воронку. На твердых средах образует крупные шероховатые серовато-белые колонии (R-формы) диаметром 2-3 мм, типичными считают характерные волокнистые колонии («голова Медузы» или «львиная грива»), образованные переплетающимися цепочками бактерий. Рост вирулентных штаммов на плотных средах и желатине настолько характерен, что может служить диагностическим признаком. На свернувшейся (30 минут при 80°С) лошадиной сыворотке растет в виде гладких прозрачных S-колоний, тянущихся за петлей.

Потребность в кислороде. Палочка сибирской язвы — аэроб или факультативный анаэроб; в анаэробных условиях (либо при значительном варьировании температурного режима) образует мелкие единичные колонии. При культивировании в микроаэрофильных условиях всегда образует гладкие (S), слизистые (М) или смешанные (SM) колонии.

Спорообразование. Споры Bacillus anthracis овальной формы, размером 0,8-1,0 ´ 1,5 мкм; сильно преломляют свет. Они очень легко образуются на бедных питательных средах, а при свободном доступе кислорода — даже в дистилляте или нефиксированных мазках (последнее следует иметь в виду при работе с вирулентными штаммами). На плотных средах спорообразование идет быстрее, чем на жидких; через 32-48 ч при 37°С оно бывает практически полным. Прекращается полностью при 15°С и 42-43°С. Скорость прорастания зависит от температуры (оптимум 37°С) и возраста спор; молодые споры в оптимальных условиях прорастают за 1-1,5 ч, старые – за 2-10 ч.

Биохимия. Возбудитель образует кислоту без газа на средах с глюкозой, фруктозой, маль­тозой и декстрином. Слабое или отсроченное образование газа наблюдают на средах с гли­церином и салицином (не у всех штаммов). Кислотообразования не находят на средах с арабинозой, рамнозой, маннозой, галактозой, раффинозой, лактозой, инсулином, маннитом, дульцитом, сорбитом и инозитом. Гидролизует крахмал; образует ацетилметилкарбинол и лецитиназу. Bacillus anthracis очень медленно и слабо коагулирует жидкую желточную сре­ду; нередко изоляты вообще лишены такой способности. Положительный результат можно ожидать не ранее 5-7 сут. инкубирования при 37°С; в то же время сапрофитные бациллы разлагают ее за 6-10 ч. В отличие от сапрофитов, палочки сибирской язвы лишены фосфатазы и не разлагают фосфаты, содержащиеся в питательной среде. Молоко свертывают за 3-5 сут.; затем сгусток медленно пептонизируется и разжижается; выделяется аммиак и (в связи с окислением тирозина) накапливается бурый пигмент.

Антигенная структура. Выделяют 3 группы основных антигенов (Аг) Bacillus anthracis, 2 из которых (капсульные Аг и токсин) кодируются плазмидами; отсутствие одной или обеих делает бак­терии авирулентными.

Капсульные Аг заметно отличаются по химической структуре от прочих капсулярных Аг бактерий; представлены полипептидами, соединенными с молекулами D-глутаминовой кислоты. По антигенным свойствам выделяют один серотип. AT к капсульным Аг не проявляют защитное действие.

Соматические Аг представлены полисахаридами клеточной стенки; состоят из D-галактозы и N-ацетилглюкозамина в эквимолярных соотношениях; перекрестно реагируют с AT к капсульному полисахариду пневмококков типа 14; введение Аг вызывает синтез AT, не проявляющих защитное действие.

Токсин обычно образуют in vivo (можно выделить из плевральных и перитонеальных экссудатов зараженных животных); in vitro образование токсина можно индуцировать культивированием на средах, содержащих сыворотку; пик образования приходится на18-20 ч инкубирования.

Токсин имеет сложную структуру: включает протективный Аг (взаимодействует мембранами клеток и опосредует проявление активности других компонентов); летальный фактор (проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких) и отечный фактор (проявляет эффект кальмодулиннезависимой аденилатциклазы, повышает концентрацию цАМФ, вызывает развитие отеков); эти компоненты по отдельности не способны проявлять токсическое действие. Структуры компонентов токсина представлены белками или липопротеинами; их молекулы термолабильны, серологически дифференцируемы и иммуногенны.

Патогенность Bacillus anthracis прямо зависит от капсуло- и токсинообразования; штаммы, не проявляющие подобные свойства, обычно авирулентны.

Капсула защищает бактерии от действия вне- и внутриклеточных продуктов фагоцитов и препятствует поглощению бактерий; на начальных этапах заболевания капсула — важнейший фактор вирулентности. Способностью к капсулообразованию также обладают некоторые вакцинные штаммы (например, Пастера или второй вакцинный штамм Ценковского).

Токсин опосредует проявление признаков и симптомов сибирской язвы. Аккумуляция токсина в тканях и его воздействие на ЦНС приводят к летальному исходу на фоне легочной недостаточности и гипоксии. Разработаны сибиреязвенные анатоксины, но их структура и механизмы действия изучены не полностью.

Лабораторная диагностика в определенной степени зависит от клинической формы заболевания. Для исследования берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбун­кула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные бок­сы. Анализы предусматривают не только проведение рутинных бактериологических исследований, но и заражение лабораторных животных для оконча­тельного уточнения диагноза.

Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме (рис. 1) с посевом на обычные питательные среды, определением подвижности, окраской по Граму и изучением биохими­ческих особенностей (дифференциально-диагностические признаки Bacillus anthracis и родственных спорообразующих анаэробов представлены в табл. 2 и 3).

Серологические исследования позволяют идентифицировать инфекцию у больных и реконвалесцентов; возбудитель можно выявлять AT, мечеными флюоресцеинами (осо­бенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РНГА и ИФА.

Кожные пробы (реакция ГЗТ) проводят внутрикожным введением 0,1 мл бактериально­го аллергена (антраксин); применяют для ретроспективной диагностики при эпидемио­логических исследованиях.

Реакция Асколи имеет большое значение, т.к. позволяет идентифицировать возбудитель при отрицательных результатах бактериологических исследований. Однако для прижиз­ненной диагностики она не имеет серьезных преимуществ перед вышеуказанными бакте­риологическими и серологическими методами.

Типирование бактериофагом. Возможно проведение дифференциальной диагности­ки с помощью бактериофагов.

Отличительная особенность возбудителя — высокая чувствительность к пеницил­лину; выращивание на средах, содержащих пенициллин, приводит к проявлению фено­мена «жемчужного ожерелья».

Биологическая проба. Заражение подопытных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 суток, морские свинки и кролики — через 2-4 суток. Наблюдение продолжают в течение 10 дней. У павших животных обычно исследуют печень, селезенку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца, места введения заразного материала. Делают посевы на питательные среды.

Профилактика

Иммунизация. Для профилактики зоонозов иммунизируют животных живой вакциной, приготовленной из некапсулированного штамма Bacillus anthracis, или протективным Аг.

Таблица 2. Морфология, особенности роста и патогенность В. anthracis и родственных спорообразующих анаэробов

Признак	В. anthracis	В. cereus	В. subtilis	В. mesentericus В. pumilus	В. megaterium	В. mycoides
Капсулообразование в атмосфере с повышенным содержани­ем СО2	+	–	–	–	–	–
Подвижность (висячая капля)	–	+	+	+	+	+
Гемолиз ЭБ	–	+	–	±	–	+
Рост на жидких средах:
на бульоне	Среда с осадком (хлопьевидным), про­зрачная, без пленки, кольцо около стенок легко смывается	Среда мутная, осадок трудноразбиваемый, крошковатый, прочные пленка и пристеночное кольцо	Бульон мутный, при образовании пленки среда просветляется	Бульон остается почти прозрачным, на поверхности среды морщинистая пленка	Помутнение среды, пленки не образует, осадок не­значительный	Помутнения среды нет, на дне ватообразный осадок, пленки не образует
на молоке	Подкисление, свертывание и пептонизация (медленная)	Пептонизация быст­рая, со свертыванием или без него	Подщелачивание, медленная пептониза-ция	Пептонизация мед­ленная, иногда свертывание	Пептонизация	Пептонизация, иногда, может быть без свертывания
на твердых средах:
на агаре	Серо-белые, как пу­шинки, колонии, при увеличении вид «львиной гривы»	Колонии белые, твердые, круглые, иногда окрашенные в желтоватый цвет, по краям извитые нити	Колонии белые или сероватые, ползущие на стенку пробирки, в конденсатной воде пленка	Толстый матово-белый морщинистый налет, образует пленку в конденсатной воде	Колонии слизистые, желтовато-белые, темнеют при наличии тирозина в среде	Войлоковидные нало­жения, ползущие по поверхности среды
на желатине	Медленное разжиже­ние, образует фигуру «перевернутой елочки»	Разжижение быстрое и сильное, вдоль укола образует гори­зонтальные отростки	Колония окружена венком из отростков, на поверхности раз­жиженного желатина образует пленку	Колонии круглые, разжижение медлен­ное	Медленное воронко­образное разжижение	Быстрое разжижение
Патогенность:
для мышей	+	+	–	–	–	–
для морских сви­нок и кроликов	+	–	–	–	–	–

ЭБ — эритроциты барана.

Таблица 3. Метаболические особенности В. anthracis и родственных спорообразующих анаэробов

Признак	В. anthracis	В. cereus	В. subtilis	В. mesentericus В. pumilus	B. megateritum	В. mycoides
Лакмусовая сыворотка	Краснеет	Синеет	Синеет	Краснеет	—	—
Ферментация:
Свернутой яичной среды	± (медленно)	+	—	+	—	+
Арабинозы	–	–	+К	+ К	± К	–
Ксилозы	–	–	+К	+К	± К	–
Крахмала	+	+	+	–	+	+
Салицина	± (медленно)	+	Сведений нет	+	Сведений нет	Сведений нет
Восстановление метиленового синего в среде (через 48ч)	–	+	±	–	Сведений нет	–
Образование уреазы	—	±	~	—	±	±
Редукция нитратов	±	±	+	–	±	±
Реакция Фогеса-Проскауэра	+	–т	+	+	—	±
Чувствительность к пенициллину	+	~	—	—	~	—

К — ферментация с образованием кислоты.

Рисунок 1. Принципиальная схема бактериологического выделения

возбудителя си­бирской язвы

Bacillus cereus

Bacillus cereus (от лат. cera — воск, свеча) широко распространена в природе, морфологически сходна с Bacillus anthracis (характерно расположение микробных тел в виде штакетника), но обладает подвижностью, чувствительна к действию g-фага бацилл и гемолизирует эритроциты барана. Вызывает спорадические случаи пищевых отравлений у человека. Температурный оптимум роста 30°С, оптимум рН 7-9,5. На МПА образует «распластанные» колонии с неровными краями; на КА колонии «распластанные», зернистые, с широкой зоной гемолиза, на яичном агаре образует широкую зону преципитации белого цвета (эффект бактериальной лецитиназы), зона быстро растет, и через несколько суток инкубации охватывает всю поверхность чашки. Колонии, выросшие на агаре, имеют характерный восковидный вид. На жидких средах бацилла образует белый хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона. Следует отметить высокую протеолитическую активность микроорганизма — разжижает желатин в течение 1-4 сут (80% штаммов); все штаммы образуют лецитиназу и ацетилметилкарбинол, расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов — также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инулин, дульцит и декстрин.

Bacillus cereus вызывает два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов); интоксикацию опосредует энтеротоксин, образуемый вегетирующими формами, прорастающими из спор устойчивых к определенным термическим режимам обработки пищевых продуктов (обычно овощей). Бациллы образуют токсины только in vivo, во время прорастания спор.

Первый тип отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч), характерны изнуряющие диарея и рвота. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсемененной большим количеством микроорганизмов. Часты случаи отравлений в связи с употреблением жареного риса, содержащего проросшие споры Bacillus cereus, эти случаи не менее часто ошибочно связывают с отравлениями стафилококковым энтеротоксином. Подобные отравления можно считать токсикозами (или гнилостной инфекцией), связанными не столько с активностью токсина, сколько с действием метаболитов, накапливающихся в пищевых продуктах.

Второй тип отравлений характеризует более продолжительный инкубационный период (около 17 ч); патогенез полностью опосредован действием энтеротоксина, боль­ные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею; этот комплекс симптомов часто и ошибочно принимают за пищевые отравления, вызванные клостридиями.

Патогенез обоих типов отравления в большей или меньшей степени связан с действием энтеротоксина; механизмы его действия остаются до конца не изученными, но его актив­ность не связана со стимуляцией аденилатциклазы.

Предрасполагающие факторы — различные нарушения иммунитета.

Вторичные иммунодефициты, вызванные применением цитостатиков и иммунодепрессантов, а также различными патологическими состояниями, сопровождаемыми иммунодепрессиями (например, острыми лейкозами), могут быть причиной тяжелых, часто фатальных инфекций Bacillus cereus с массированными бактериемиями, эндокардитами и менингитами.

Применение b-лактамных антибиотиков для подавления роста Bacillus cereus мо­жет вызвать бурный рост резистентных штаммов.

Протезы. Вероятность развития непищевых инфекций также велика у лиц с протезиро­ванными органами, катетерами, а также у пациентов с гемодинамическими нарушениями.

Диагностика

Диагностическим признаком считают обнаружение в подозрительных про­дуктах более 10⁵ бактерий в 1 г/мл продукта либо 10²-10³ бактерий в 1 г/мл каловых и рвотных масс или промывных вод.