Интерфаза, её периоды. Точки рестрикции

Основное требование к клетке, вступающей в S-фазу - интактность ДНК, так как репликация поврежденной ДНК приведет к передаче генетических аномалий потомству. Поэтому клетки, подвергшиеся мутагенным воздействиям, вызывающим разрывы ДНК (УФ- и g-облучение, алкилирующие соединения и др.), останавливаются в G1 и не входят в S-фазу. Остановка в G1 наблюдается не только после ДНК-повреждающих воздействий, но и при других состояниях, в том числе приводящих к нарушениям числа хромосом - при незавершенности предыдущего клеточного цикла митозом (расхождением хромосом), при неправильной сегрегации хромосом во время митоза , приведшей к образованию микроядер, а также при разрушении микротрубочек , которое впоследствии может вызвать нарушения митоза . Остановка в G1 может быть необратимой, как это наблюдается в случае g-облучения или обратимой, прекращающейся с окончанием действия фактора, ее вызвавшего, например, при восстановлении нормального пула нуклеотидов или при реставрации системы микротрубочек.

До начала клеточного цикла белок p27 , находясь в высокой концентрации, предотвращает активацию протеинкиназ CDK4 или CDK6 циклинами D1 , D2 или D3 . В таких условиях клетка остается в фазе G0 или ранней фазе G1 до получения митогенного стимула. После адекватной стимуляции происходит уменьшение концентрации ингибитора p27 на фоне возрастания внутриклеточного содержания циклинов D. Это сопровождается активацией CDK и, в конечном счете, фосфорилированием белка pRb , освобождением связанного с ним фактора транскрипции E2F и активацией транскрипции соответствующих генов.

На этих ранних стадиях фазы G1 клеточного цикла концентрация белка p27 все еще остается довольно высокой. Поэтому после прекращения митогенной стимуляции клеток содержание этого белка быстро восстанавливается до критического уровня и дальнейшее прохождение клеток через клеточный цикл блокируется на соответствующем этапе G1. Эта обратимость возможна до тех пор, пока фаза G1 в своем развитии не достигает определенной стадии, называемой точкой перехода , после прохождения которой клетка становится коммитированной к делению, и удаление факторов роста из окружающей среды не сопровождается ингибированием клеточного цикла. Хотя с этого момента клетки становятся независимыми от внешних сигналов к делению, они сохраняют способность к самоконтролю клеточного цикла.

Ингибиторы CDK семейства INK4 ( p15 , p16 , p18 и p19 ) специфически взаимодействуют скиназами CDK4 и CDK6 . Белки p15 и p16 идентифицированы как супрессоры опухолевого роста, и их синтез регулируется белком pRb . Все четыре белка блокируют активацию CDK4 и CDK6, либо ослабляя их взаимодействие с циклинами, либо вытесняя их из комплекса. Хотя оба белка p16 и p27 обладают способностью ингибировать активность CDK4 и CDK6, первый имеет большее сродство к этим протеинкиназам. Если концентрация p16 повышается до уровня, при котором он полностью подавляет активность киназ CDK4/6, белок p27 становится основным ингибитором киназы CDK2 .

На ранних стадиях клеточного цикла здоровые клетки могут распознавать повреждения ДНК и реагировать на них задержкой прохождения клеточного цикла в фазе G1 до репарации повреждений. Например, в ответ на повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым светом или ионизирующей радиацией, белок p53 индуцирует транскрипцию гена белка p21 . Повышение его внутриклеточной концентрации блокирует активацию CDK2 циклинами E или A . Это останавливает клетки в поздней фазе G1 или ранней S-фазе клеточного цикла. В это время клетка сама определяет свою дальнейшую судьбу - если повреждения не могут быть устранены, она вступает в апоптоз .

Существуют две разнонаправленные системы регуляции G1/S - перехода: положительная и отрицательная.

Система положительно регулирующая вход в S-фазу, включает гетеродимер E2F-1/DP-1 и активирующие его циклин-киназные комплексы .

Другая система тормозит вход в S-фазу. Она представлена опухолевыми супрессорами р53 иpRB , которые подавляют активность гетеродимеров E2F-1/DP-1.

Нормальная пролиферация клеток зависит от точного баланса между этими системами . Соотношение между этими системами может изменяться, приводя к изменению скорости пролиферации клеток.

В G₁-фазе точка рестрикции (R) отличается от остальных контрольных точек, поскольку она не определяет специальное состояние клетки, идеальное для перехода в следующую фазу, а меняет дальнейшее направление жизни клетки. У позвоночных после того, как клетка пробыла в G₁-фазе около трёх часов, она вступает в точку рестрикции, где клетка решает, пойдёт ли она дальше по клеточному циклу или же перейдёт в стадию покоя — G₀-фазу.

Эта точка также разделяет G₁-фазу на две половины: премитотическую и постмитотическую. Между началом G₁-фазы (которая начинается в новой клетке после митоза) и R клетка находится в G₁-постмитотической подфазе или постмитотической фазе. После R и перед S-фазой клетку называют находящейся в G₁-пресинтетической подфазе или пресинтетической фазе G₁-фазы.

Чтобы клетка прошла через G₁-постмитотическую фазу, необходимо высокое содержание факторов роста и стабильный уровень синтеза белков, иначе клетка перейдёт в G₀-фазу.

Некоторые авторы утверждают, что точка рестрикции и G₁/S-точка есть одно и то же, но в более новых работах выяснилось, что это — две различные точки G₁-фазы, в которых отмечается прогресс клетки. Первая, точка рестрикции, зависит от факторов роста и определяет, уходить ли клетке в G₀-фазу, в то время как вторая контрольная точка зависит от питательных веществ и определяет, уходить ли клетке в S-фазу. Некоторые разногласия между исследователями приписывают тому, что одни из них изучали клетки млекопитающих, а другие — дрожжей.

G₁/S-контрольная точка

G₁/S-контрольная точка находится между началом G₁-фазы и S-фазы, в которой определяется переход клетки в S-фазу. Факторами, из-за которых клетка может не вступить в S-фазу, могут быть недостаток факторов роста, повреждения ДНК и другие особые обстоятельства.

В этой точке образование комплексом G₁/S-циклинов и циклинзависимых киназ (ЦЗК) подводит клетку к вступлению в новый цикл деления. Потом эти комплексы активируют S-ЦЗК комплексы, которые подводят клетку к репликации ДНК в S-фазе. Одновременно с этим активность комплекса стимуляции анафазы значительно уменьшается, что позволяет активироваться S- и М-циклинам.

Если клетка не может перейти в S-фазу, она вступает в покоящуюся G₀-фазу, где нет ни клеточного роста, ни деления^[.

Общая ситуация выгладит так. В клетке постоянно присутствуют специальные белки-ферменты, которые путем фосфорилирования других белков (по остаткам серина, тирозина или треонина в полипептидной цепи), регулируют активность генов, ответственных за прохождение клетки по тому или иному периоду клеточного цикла. Эти белки-ферменты называются циклин-зависимыми протеинкиназами (cdc). Имеется несколько их разновидностей, но они все обладают сходными свойствами. Хотя количество этих циклин-зависимых протеинкиназ может варьировать в различных периодах клеточного цикла, они присутствуют в клетке постоянно, независимо от периода клеточного цикла, то есть они имеются в избытке. Другими словами, их синтез или количество не лимитирует или не регулирует прохождение клеток по клеточному циклу. Однако при патологии, если синтез их нарушен, снижено их количество или имеются мутантные формы с измененными свойствами, то это, конечно же, может повлиять на течение клеточного цикла.

Почему же такие циклин-зависимые протеинкиназы сами не могут регулировать прохождение клеток по периодам клеточного цикла. Оказывается, что они находятся в клетках в неактивном состоянии, а для того чтобы они активировались и начали работать, необходимы специальные активаторы. Ими являются циклины. Их также много разных типов, но они присутствуют в клетках не постоянно: то появляются, то исчезают. В разные фазы клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь с Cdk образуют различные Cdk_циклиновые комплексы. Эти комплексы регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются G1-, G1/S-, S- и М-Cdk (рис. из моих рис. циклины). Так, например, прохождение клетки по G1 периоду клеточного цикла обеспечивает комплекс циклин-зависимой протеинкиназы_2 (cdk2) и циклина D1, циклин-зависимой протеинкиназы_5 (cdk5) и циклина D3. Прохождение через специальную точку рестрикции (R_пункт) периода G1 контролирует комплекс cdc2 и циклина С. Переход клетки из G1 периода клеточного цикла в S период контролирует комплекс cdk2 и циклина Е. Для перехода клетки из S периода в G2 период необходим комплекс cdk2 и циклин А. Циклин-зависимая протеинкиназа_2 (cdc2) и циклин В участвуют в переходе клетки из G2 периода в митоз (М период). Циклин H в соединении с cdk7 необходим для фосфорилирования и активации cdc2 в комплексе с циклином В.

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
G1 период	cdk2 + циклин D1 cdk5 и циклин D3
R_пункт периода G1	cdc2 + циклин С
переход из G1 в S период	cdk2 + цикли Е
переход из S в G2 период	cdk2 + циклин А
переход из G2 периода в митоз (М период)	cdc2 + циклин В
циклин H + cdk7 необходим для фосфорилирования и активациии cdc2 в комплексе с циклином В

Циклины - новый класс белков, открытый Тимом Хантом, которые играют ключевую роль в управлении делением клеток. Название «циклины» появилось из-за того, что концентрация белков этого класса изменяется периодически в соответствии со стадиями клеточного цикла (например, падает перед началом деления клетки).

Первый циклин был обнаружен Хантом в начале 1980-х годов, во время опытов с икрой лягушек и морских ежей. Позднее циклины были найдены и в других живых существах.

Оказалось, что эти белки мало изменились в ходе эволюции, как и механизм управления клеточным циклом, который дошел от простых дрожжевых клеток до человека в «законсервированном» виде.

Тимоти Хант (R. Timothy Hunt) вместе с соотечественником-англичанином Полом Нерсом (Paul M. Nurse) и американцем Лиландом Хартуэллом (Leland H. Hartwell) в 2001 году получили нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие генетических и молекулярных механизмов регуляции клеточного цикла - процесса, который имеет важнейшее значение для роста, развития и самого существования живых организмов

Контрольные точки клеточного цикла

1.Точка выхода из G1_фазы, называемая Старт - у млекопитающих и точкой рестрикции у дрожжей. После перехода через точку рестрикции R в конце G1 наступление S становится необратимым, т.е. запускаются процессы ведущие к следующему делению клетки.
2. Точка S - проверка точности репликации.

3. Точка G2/M_перехода - проверка завершения репликации.
4. Переход от метафазы к анафазе митоза.

Регуляция репликации

Перед началом репликации Sc ORC_комплекс (origin recognition complex) садится на ori - точку начала репликации. Cdc6 представлен во всем клеточном цикле, но его концентрация возрастает вначале G1, где он связывается c ОRC комплексом, к которому затем присоединяются Mcm белки с образованием pre-replicative complex (pre-RC). После сборки pre-RC клетка готова к репликации.

Для инициации репликации S-Cdk соединяется с протеинкиназой (?), которая фосфорилирует pre-RC. При этом Cdc6 диссоциирует от ОRC после начала репликации и фосфорилируется, после чего убиквитинируется SCF и деградирует. Изменения в pre-RC препятствуют повторному запуску репликации. S-Cdk так же фосфорилирует некоторые Mcm белковые комплексы, что запускает их экспорт из ядра. Последующая дефосфориляция белков вновь запустит процесс образования pre-RC.

Циклины - активаторы Cdk. Циклины, так же как и Cdk вовлечены в различные, помимо контроля клеточного цикла, процессы. Циклины разделяются на 4 класса в зависимости от времени действия в клеточном цикле: G1/S, S, M и G1 циклины.
G1/S циклины (Cln1 и Cln2 у S. cerevisiae, циклин E у позвоночных) достигает максимальной концентрации в поздней G1_фазе и падает в S_фазе.

G1/S cyclin-Cdk комплекс запускает начало репликации ДНК выключая различные системы подавляющие S-phase Cdk в G1_фазе G1/S циклины также инициируют дупликацию центросом у позвоночных, образование веретенного тела у дрожжей. Падение уровня G1/S сопровождается увеличением концентрации S циклинов (Clb5, Clb6 у Sc и циклин A у позвоночных), который образует S циклин-Cdk комплекс который напрямую стимулирует ДНК репликацию. Уровень S циклина остается высоким в течении всей S, G2_фаз и начала митоза, где помогает началу митозу в некоторых клетках.

М-циклины (Clb1,2,3 и 4 у Sc, циклин B у позвоночных) появляется последним. Его концентрация увеличивается, когда клетка переходит к митозу и достигает максимума в метафазе. М-циклин-Cdk_комплекс включает сборку веретена деления и выравнивание сестринских хроматид. Его разрушение в анафазе приводит к выходу из митоза и цитокиезу. G1 циклины (Cln3 у Sc и циклин D у позвоночных) помогает координировать клеточный рост с входом в новый клеточный цикл. Они необычны, так как их концентрация не меняется от фазы клеточного цикла, а меняется в ответ на внешние регуляторные сигналы роста.