Биохимические свойства. Pseudomonas aeruginosa — выраженный хемоорганотроф; метаболизм дыхательный

Pseudomonas aeruginosa — выраженный хемоорганотроф; метаболизм дыхательный, никогда не бродильный; строгий аэроб. В качестве источ­ника энергии синегнойная палочка использует Н₂ или СО. Универсальный акцептор элект­ронов — молекулярный кислород. Как и большинство патогенных гноеродных микроорганизмов, каталазоположительна. Подобно прочим аэробам, синтезирует цитохромоксидазу (индофенолоксидаза), а оксидазный тест — один из ведущих при идентифика­ции этой палочки. Синтезирует триметиламин, придающий культурам запах жасмина, винограда или карамели. Не нуждается в факторах роста. Способна расти на протяжении нескольких пассажей в чисто минеральной среде при добавлении подходящего единственно­го источника углерода. Ассимилирует ацетаты, пируваты, сукцинаты. Может утилизировать глюкозу, L-аланин при их содержании в среде не менее 0,5%.

Протеолитическая активность сильно выражена. Разжижает желатин, свертывает сыворотку крови, гидролизует казеин; утилизирует гемоглобин (большинство патоген­ных штаммов на кровяном агаре образует зону b-гемолиза). Синтезирует гиалуронидазу; гидролизует не только белки, но и отдельные аминокислоты (например, валин и аланин). Лизин и орнитин не декарбоксилирует; восстанавливает нитраты до нитритов и далее до молекулярного азота.

Сахаролитическая активность низкая; окисляет только глюкозу с образованием глюконовой кислоты.

Ввиду явного преобладания протеолитических свойств над сахаролитической активнос­тью для идентификации синегнойной палочки среды Гисса для пестрого ряда готовят с малым содержанием пептона (до 0,1%) и повышенной концентрацией углеводов (до 2%). При посеве можно наблюдать, помимо четкой реакции с глюкозой, непостоянную фер­ментацию фруктозы и маннита. Тест Хью-Лейфсона положителен только с глюкозой (в аэробных условиях).

Пиоцины. Pseudomonas aeruginosa продуцирует бактериоцины — пиоцины (аэругеноцины); способность к синтезу и чувствительность к ним широко варьируют у различных штаммов, на чем основано пиоцинотипирование псевдомонад, применяемое для внутривидовой дифференциальной диагностики культур. Вирулентные штаммы либо активно продуцируют пиоцины, либо подвержены их действию. В основу метода положены следующие положения.

1. Пиоцины различных штаммов по-разному действуют на индикаторные штаммы.

2. Штамм-продуцент пиоцина резистентен к образуемому им бактериоцину.

3. Различные штаммы обладают разной чувствительностью к набору индикаторных пиоцинов.

4. Пиоцинотипирование используют при эпидемиологической оценке выделенных культур. Для разделения культур на пиоцинотипы используют два основных методических принципа.

– Типирование по продукции или активности пиоцинов в отношении набора индикаторных штаммов.

– Типирование по чувствительности штаммов к наборам известных индикаторных пиоцинов. Соответственно культуры получают наименования: «пиоцинотип» — штамм или культура, подверженная литическому воздействию определенного типа пиоцина; «пиоциногенотип» — штамм или культура, образующая определенный тип пиоцина.

Пигментообразование

Характерный и имеющий важное диагностическое значение признак (у 70-80% клинических изолятов). Среди пигментов наиболее часто встречают:

а. Водорастворимый феназиновый пигмент пиоцианин, окрашивающий питательную сре­ду, отделяемое ран и перевязочный материал в сине-зеленый цвет. В анаэробных услови­ях пигмент обычно бесцветный, но даже встряхивание среды (частичная аэрация) приво­дит к появлению окраски.

б. Подавляющее большинство культур образует зеленый пигмент флюоресцеин, или лиовездин, флюоресцирующий при УФ-облучении (с длиной волны 254 нм); для обнаруже­ния можно воспользоваться лампой Вуда.

в. Некоторые штаммы могут синтезировать и другие пигменты — пиорубин (красный), пиомеланин (черно-коричневый), L-оксифеназин (желтый).

г. Оптимальная температура для синтеза пигментов in vitro 30-37°С. Кроме того, необходи­мо дополнение сред глицерином, аминокислотами (особенно аланином), ионами (особен­но Mg²⁺ и К⁺). Высоковирулентные штаммы отличает значительное образование пиоцианина, проявляющего свойства бактериоцина, действующего на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также имеющего умеренную фунгицидную активность.

д. При выделении культур иногда наблюдают атипичные непигментированные или слабопигментированные формы. Обычно их идентификация требует дополни­тельного тестирования, что усложняет диагностические исследования. Непигментированные штаммы составляют 8,3-18%, а 6-37% всех изолятов может быть пигмен­тировано слабо.

Основные механизмы изменчивости культуральных признаков Pseudomonas aeruginosa — лизогенная конверсия и мутации.

Отсутствие или утрата способности к пигментообразованию также могут обусловливать сопут­ствующая микрофлора, действие антибиотиков, дефицит О₂ или смена среды обитания с нару­шением физиологических свойств бактерий, вызванных искажением белкового метаболизма в патологически измененных тканях, особенно при злокачественных новообразованиях.

Пиомеланин предохраняет микроорганизм от неблагоприятного действия изменений концентра­ции О₂ и УФ-лучей. Его наличие также помогает бактериям переносить гипоксию при инфекци­ях глубоких тканей. Подобные свойства пигмента дают основание считать меланинобразующие штаммы более вирулентными.

Патогенез

По сравнению с Pseudomonas aeruginosa, подавляющее большинство микро­организмов данной группы, обитая в почве и воде, имеют ограниченное клиническое значение (за исклю­чением В. mallei и В. pseudomallei — возбудителей сапа и мелиоидоза соответственно). Высокая частота выделения и бо­лее выраженная патогенность Pseudomonas aeruginosa связаны с наличием у этого микроорганизма ряда факторов вирулентности, способству­ющих колонизации и инфицированию тканей организма человека. К детерминантам вирулентности относятся факто­ры, способствующие адгезии, инвазии, цитотоксичности.

Адгезия Pseudomonas aeruginosa к клеткам эпителия опосредуется ворсинками (пилями), которые обладают способностью специфически связываться с GM-1 ганглиозидными рецепторами эпителия. Секретируемый микроорганизмом фермент нейраминидаза, отщепляя остатки сиаловых кислот от рецептора, облегчает специфическую адгезию.

Локальное и системное действие на организм млекопи­тающих оказывают и другие секретируемые Pseudomonas aeruginosa ферменты. Фосфолипаза разрушает цитоплазматические мембраны эукариотических клеток, инактивирует опсонины, гидролизует сурфактант легких. Цитотоксическим действием (в том числе и в отношении макрофагов), а также способностью подавлять биосинтез белка обладает экзотоксин А. Биосин­тез белка ингибируется также экзоэнзимом S. Эластаза (протеаза II) раз­рушает иммуноглобулины и компоненты комплемента, ингибирует активность нейтрофилов. Функцию нейтрофилов и лимфоцитов подавляет токсин – лейкоцидин. Цитотоксичес­ким эффектом обладает и пигмент пиоцианин, обусловли­вающий сине-зеленую окраску среды при выращивании микроорганизма в культуре или гнойного отделяемого ин­фицированных ран.

Мощным индуктором системной воспалительной реак­ции является липополисахарид Pseudomonas aeruginosa. Часть штаммов продуцируют капсульный полисахарид альгинат. Штаммы, проду­цирующие альгинат, обычно выявляются у пациентов с хро­ническими инфекциям. Альгинат способствует формированию на поверхности эпителия пленки, которая обеспечивает защиту патогена от воздействия факторов резистентности макроорганизма и антибиотиков.

Для Pseudomonas aeruginosa характерно разнообразие весьма тонких меха­низмов регуляции экспрессии факторов вирулентности. Ак­тивность механизмов регуляции направлена на быструю адап­тацию микроорганизма к меняющимся условиям обитания и обеспечение максимальной экономичности с энергетичес­кой точки зрения. При пребывании микроорганизма во внеш­ней среде факторы вирулентности не синтезируются, при попадании же во внутреннюю среду организма млекопитаю­щих начинается интенсивный синтез этих белков, способ­ствующих развитию инфекционного процесса. Сигналами для микроорганизма о попадании во внутреннюю среду могут быть изменения температуры, рН среды, контакт с мембра­ной эукариотических клеток. Распознавание таких сигналов осуществляют специфические рецепторы, локализованные в клеточной стенке микроорганизма. Передачу сигнала, обес­печивающего начало синтеза фактора вирулентности, от ре­цептора к гену, кодирующему белок, осуществляют двух­компонентные системы передачи сигнала. Такие системы действуют по принципу последовательной активации фер­ментов в реакции фосфорилирования и являются универсальными в регуляции вирулентности микроорганизмов. У Pseudomonas aeruginosa описаны двухкомпонентные системы, регулирующие образованиe ворсинок и синтез экзоэнзимов. Кроме регуляции синтеза факторов вирулентности на уровне от­дельных микробных клеток, у Pseudomonas aeruginosa регуляция происходит и на уровне популяции. Речь идет о феномене "кооперативной чувствительности" или "чувства кворума" (quorum sensing), заключающемся в накоплении в микробной популяции низ­комолекулярных соединении (гомосеринлактонов), осуще­ствляющих при достижении определенной концентрации депрессию синтеза большинства факторов вирулентности. Таким образом, экспрессия генов вирулентности оказыва­ется зависящей от плотности микробной популяции. Био­логический смысл феномена, вероятно, связан с коорди­нированным началом синтеза факторов вирулентности только после достижения микробной популяцией определенного уровня плотности. Регуляции на уровне кооперативной чув­ствительности у Pseudomonas aeruginosa подвержена экспрессия большинства факторов вирулентности и вторичных метаболитов.

У Pseudomonas aeruginosa описана система секреции протеинов (так называ­емая протеазаIII), обеспечивающая не только выведение экзо­энзимов из внутренней среды бактериальной клетки, но и их транслокацию внутрь эукариотической клетки, то есть к чувствительным мишеням . К протеинам, секретируемым описанной системой, относятся и факторы вирулентности.

Таким образом, патогенное действие Pseudomonas aeruginosa в первую очередь обусловлено образо­ванием веществ, проявляющих свойства экзотоксинов, и высвобождением эндотоксинов при гибели и распаде бактериальных клеток.

Экзотоксины бактерий представлены продуктами жизнедеятельности с широким спек­тром биологической активности; среди них основное значение имеют:

Экзотоксин А — белок с M_r 66 000-72 000 Да; молекула токсина состоит из одной полипептидной цепи с 4 дисульфидными связями; свободных сульфгидрильных групп не содержит. Характерные особенности: наличие аргинина в качестве N-концевой аминокислоты и высокое содержание кислых аминокислот. Токсин термолабилен, рас­щепляется трипсином, панкреатической эластазой, проназой, а также под действием собственных протеолитических ферментов. Для синтеза in vitro необходимы хорошая аэрация и соответствующая температура (оптимум 32°С). Механизм действия свя­зан с модификацией белков через АТФ-рибозилирование. Его мишень — фактор элон­гации 2 (ФЭ-2); следствие — нарушение организации матрицы белкового синтеза (аналогичным свойством обладает дифтерийный токсин). Действие на подопытных животных превосходит токсичность всех остальных продуктов синегнойной палочки и проявляется в общем токсическом действии, отеках, некрозах, гипертензии с последую­щим коллапсом, метаболическом ацидозе, дыхательной недостаточности, параличе внут­риклеточного синтеза белков и т.д. Гистологически выявляют печеночно-клеточный не­кроз, геморрагические поражения легких, тубулярный некроз почек и т.д.

Экзоэнзим S — белок с АДФ-трансферазной активностью; термостабилен; инактивируется под действием денатурирующих и восстанавливающих агентов, ионов Cu²⁺ и Fe²⁺; AT к экзотоксину А его не нейтрализуют. Образуется в двух формах: первая — ферментативно активный белок с М_r 49 000 Да; вторая — неактивный белок-предше­ственник с M_r 53 000 Да. В виде очищенного детергентами препарата нетоксичен для животных (очевидно, инактивируется при очистке); in vivo вызывает глубокие патоло­гические процессы в легких.

Цитотоксин оказывает выраженное цитотоксическое действие на полиморфноядерные нейтрофилы (первоначально назывался лейкоцидином, но позднее установлено патологическое действие на любые клетки); способствует развитию нейтропении. Вызывает ультраструктурные изменения в клетках, нарушения физиологических гра­диентов К⁺, Na⁺, Са²⁺ и глюкозы через повышение проницаемости клеточных мембран; последнее обусловливает набухание клеток и потерю крупных (например, белковых) молекул. Данный токсин синтезирует 96,7% культур патогенных штаммов.

Гемолизины. Микроорганизм образует две гемолитические субстанции — термо­лабильный гемолизин с лецитиназной активностью (указанный выше как фосфолипаза С) — белок с необычно высокой для бактериальных фосфолипаз мо­лекулярной массой (78 000 Да) и термо­стабильный гемолизин - гликопептид, состоящий из L-рамнозы и 1-b-гидрооксидеканоиновой кислоты.

Сочетанное образование обоих продуктов предполагает их функциональное взаимо­действие: гликолипид подобно детергенту трансформирует фосфолипиды в раствори­мые формы (субстрат для фосфолипазы С), потенциируя тем самым ее активность. Эффективному высвобождению фосфатов способствует параллельный синтез бакте­риальной щелочной фосфатазы. Такое действие вызывают солюбилизацию и гидролиз фосфолипидов с образованием фосфорилхолинов — источника неорганических фосфатов; гемолизины приводят к развитию некротических поражений (особенно в печени и легких). Гемолизины продуцируют все клинические изоляты.

Эндотоксин и фактор проницаемости. Среди продуктов жизнедеятельности микро­организма обнаружен энтеротоксический фактор - белковой природы, термолабильный, чувствитель­ный к действию трипсина. Его патогенетическое значение оценить трудно, т.к. инфекции Pseudomonas aeruginosa, сопровождающиеся диареей, отмечают крайне редко (шанхайс­кая, или пятидневная лихорадка). Вирулентные штаммы продуцируют фактор проницае­мости (также лабильный к нагреванию и действию трипсина), участвующий в развитии патологических процессов в тканях.

Другой продукт жизнедеятельности (очевидно, участвующий в формировании пораже­ний) — нейраминидаза (нарушает процессы метаболизма веществ, содержащих ненраминовые кислоты, например, в соединительно-тканных элементах). Нейраминидаза спо­собна в 2-3 раза усиливать действие других токсинов. Также следует обратить внимание на способность Pseudomonas aeruginosa синтезировать протеолитические ферменты (по крайней мере, 3 различные протеазы, отличающиеся по своим характеристикам и субстратной специфичности).

Протеаза I (нейтральная) образуется в очень незначительных количествах; данные о ее субстратной специфичности и участии в патологических процессах отсутствуют,

Протеаза II (эластаза) обусловливает 75% всей протеолитической активности; рас­щепляет эластин, казеин, гемоглобин, фибрин, Ig, комплемент и другие белки, но слабо действует на коллаген. Мишень — пептидные связи между гидрофобными ами­нокислотами. Относится к металлопротеиназам и инактивируется хелатами, ионами тяжелых металлов и сывороточным b-макроглобулином. Синтезируется как связанный с клеткой профермент, аккумулирующийся в периплазматическом пространстве. Активируется путем ограниченного протеолиза щелочной протеазой или готовой порци­ей эластазы. Обнаружена у 85% штаммов.

Протеаза III (щелочная протеаза) гидролизует многие белки (в том числе g-интерферон), но не расщепляет эластин; внутривенное введение очищенного препарата вызы­вает кровоизлияния практически во всех внутренних органах; внутрикожное введение приводит к местным, позднее некротизирующимся кровоизлияниям.

Коллагеназа вызывает гидролиз коллагена в соединительных тканях. Основной фак­тор вирулентности при инфекционных поражениях роговицы.

Антигенная структура

Основные диагностически значимые Аг Pseudomonas aeruginosa -соматический О- и жгутиковый Н-Аг. Серологическую идентификацию культур и выяв­ление их принадлежности к определенному серотипу (серовару) проводят по наличию у выделенной культуры сочетания группоспецифичного О-Аг и типоспецифичного Н-Аг.

О-антигенный комплекс — ЛПС с белками и липидами клеточной стенки. ЛПС эндотоксина образует типо- или группоспецифический термостабильный О-Аг, на основе структуры которого проводят серологическое типирование, т.е., он основной структурный компонент О-Аг, обусловливающий его спе­цифичность. Принципиально структура ЛПС Pseudomonas aeruginosa аналогична строе­нию ЛПС прочих грамотрицательных бактерий и включает липид А (базовая структура) и О-специфические боковые цепи. Белковый компонент эндотоксина представляет анти­генный комплекс, общий для псевдомонад, т.е. родовой O-Аг: по своим свойствам и природе он аналогичен белку А других бактерий. По структуре O-Аг выделяют более 20 серогрупп, но высокая антигенная вариабельность Pseudomonas aeruginosa обусловли­вает постоянное увеличение их количества.

Н-, или жгутиковые, Аг представлены термолабильными белками низкой специфично­сти, обусловленной различиями в строении флагеллинов. Выявлено 15 различных типов Н-антигенов. О- и Н-Аг Pseudomonas aeruginosa обозначают арабскими цифрами (напри­мер, O-1; O-2; Н-1; Н-2 и т.д.), указывающими на принадлежность к определенной серогруппе (или Н-серотипу). Сочетание индексов определяет принадлежность к конкретному серовару. Н-Аг выявляют лишь у жизнеспособных, подвижных бактерий, не подвергших­ся какому-либо химическому воздействию (в частности, дезинфектантов) и в культурах, выращенных на жидких средах (особенно дополненных глицерином). Схема сероидентификации выделенных изолятов: выявление группового O-Аг; выявление типового Н-Аг; определение (по таблице) принадлежности к серовару по сочетанию О- и Н-Аг.

У мукоидных штаммов можно обнаружить капсульный К-Аг. До настоящего времени его диагностическая значимость была невелика, т.к. подходы к его идентификации по его структуре не разработаны. Однако (как более поверхностно расположенный Аг) он спо­собен маскировать О-детерминанты, искажая О-агглютинабельность.

Среди поверхностных Аг Pseudomonas aeruginosa обнаружены белковые пилиарные (фимбриальные) Аг. Их анатомическая основа — пили (фимбрии, в том числе и F-пили). Выделяют два типа пилей и столько же типов Аг. Они не играют диагностической роли, и их изучение обычно составляет предмет специальных исследований.

Патогенез

Несмотря на наличие большого набора факторов вирулентности, синегнойную палочку следует рассматривать как оппортунистический патоген, т.к. ин­фекции редко наблюдают у лиц с нормальной резистентностью и неповрежденными анато­мическими барьерами. Большинство штаммов Pseudomonas aeruginosa обладает поверхностными микроворсинками, обеспечивающими адгезию к эпителию (наиболее выраженную в воздухоносных путях). Взаимодействие с клетками реализуется через рецепторы, включаю­щие N-ацетилнейраминовые кислоты; определенную роль играет и вырабатываемая бактери­ями слизь. Прикрепление к субстратам стимулирует дефицит фибронектина, наблюдаемый при многих заболеваниях, особенно при хронических заболеваниях легких. Псевдомонады — типичные внеклеточные паразиты, и их размножение прямо обусловлено способностью противостоять действию факторов резистентности. В частности, слизь и секретируемые цитотоксины затрудняют их элиминацию фагоцитами и иммунокомпетентными клетками, что особенно выражено у пациентов с иммунодефицитами. Бактерии образуют комплекс биологически активных продуктов, обеспечивающих их неорганическим фосфором (фосфолипазы), железом (сидерофоры, нарушающие связывание железа трансферрином), и метаболиты, нарушающие гомеостаз тканей и частично стимулирующие вос­палительные реакции (например, протеазы гидролизуют эластин, способствуя внедрению Pseudomonas aeruginosa в ткани и секвестрации в артериальной стенке, а также активируют комплементарный каскад).