Анализ аминокислотного состава белков при помощи цветных реакций

Учебно-методическое пособие

«ОСНОВЫ БИОХИМИИ»

(практический курс)

для специальности

0407 Лабораторная диагностика

(I-я часть)

г. Волгоград

2007г.

Составлено в соответствии с Государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускника по специальности 0407 «Лабораторная диагностика». Учебно-методическое пособие включает биохимические методы исследования для выполнения самостоятельной работы на практических занятиях по дисциплине «Основы биохимии с методами клинико-диагностических исследований», а также задания для конроля.

Автор: Жаднова И.В., преподаватель биохимии и ТЛР ГОУЗ «ВОМК №1»

Рецензенты: Догадова И.В., зав. КДЛ МУЗ ДКБ №25

Островский О.В., зав. кафедрой биохимии ВолГМУ д.м.н.

Утверждено на заседании методического Совета колледжа (протокол № от )

Председатель С.В. Сотникова

Предназначено для студентов и преподавателей медицинских колледжей и училищ Волгоградской области.

СОДЕРЖАНИЕ

Пояснительная записка

Раздел 1. Макромолекулы, составляющие основу живой материи – организма человека.

1.1. Анализ аминокислотного состава белков при помощи цветных реакций.

Работа №1. Биуретовая реакция на белки

Работа № 2. Реакция на ароматические аминокислоты (реакция нитрования)

Работа № 3. Реакция на тирозин (реакция Миллона)

Работа № 4. Реакция на цистеин (реакция Фоля)

Работа № 5. Реакция на аргинин (реакция Сакагути)

Колическтвенное определение белка

Работа № 6. Количественное определение белка биуретовым методом

Работа № 7. Количественное определение белка по методу Лоури

Физико-химические свойсва белков

Работа № 8. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания

Работа № 9. Обессоливание растворов белка методом диализа

Работа №10. Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации

1.4. Элекро-химические свойсва белков.

Работа №11. Электрофоретическое фракционирование белков сыворотки крови на мембране из ацетатцеллюлозы

Работа №12. Турбидиметрический метод определения белковых фракций сыворотки крови.

Размеры и формы белковых молекул. Денатурация белка.

Работа №13. Осаждение белков при нагревании

Раздел 2. Химические сойства углеводов.

Работа №14 Обнаружение пентоз (проба Биаля)

Работа №15 Обнаружение лактозы и мальтозы

Работа №16 Обнаружение крахмала

Работа №17 Определение глюкозы

Раздел 3. Химические свойства липидов.

Работа №18 Обнаружение глицеринсодержащих липидов. Акролеиновая проба.

Работа №19 Обнаружение лецитина в желтке куриного яйца.

Работа №20 Обнаружение холестерина.

Работа №21 Растворение и эмульгирование жиров.

Раздел 4. Химические свойства нуклеиновых кислот.

Работа №22 Изучение состава нуклеопротеидов дрожжей.

Раздел 5. Витамины.

Работа №23 Количественное определение аскорбиновой кислоты (витамина С) в моче.

Раздел 6. Свойства ферментов, влияние различных факторов на скорость химических реакций

Работа №24 Ферментный гидролиз крахмала.

Работа №25 Кинетика ферментов. Специфичность действия ферментов.

Работа №26 Влияние температуры на активность ферментов.

Работа №27 Влияние рН среды на активность ферментов.

Работа №28 Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Раздел 6. Количественное определение ферментов.

Работа №29 Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови (по Райтману, Френкелю, 1957)

Работа №30 Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови методом конечной точки по Бессею, Лоури, Броку

Работа №31 Определение активности альфа-амилазы методом Каравея

Работа №32 Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Севелу и Товареку)

Работа №33 Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови

Работа №34 Определение активности сьюороточной холинэстеразы колориметрическим методом

Работа №35 Цитохимический метод определения миелопероксидазы (МП) нейтрофилов

Приложение 1. Список условных сокращений.

Приложение 2. Международная система единиц измерения в клинико-биохимических исследованиях.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Методическое пособие «Основы биохимии (практический курс)» составлено для студентов специальности 0407 «Лабораторная диагностика».

Цель создания учебного пособия - помощь студентам в изучении практических основ биохимии и овладении биохимическими методами анализа. Пособие составлено в соответствии с учебной программой по биохимии с методами клинико-биохимических исследований.

Данное пособие содержит основные виды исследований химических свойств белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, витаминов и ферментов, применяемых в клинико-биохимических лабораториях. В конце каждого раздела приведены задания для контроля.

В пособие включены практические работы, которые могут быть выполнены в течение 6ч, отводимых для практического занятия. В то же время даны практические работы, в которых студенты знакомятся с методами экспресс - диагностики.

В конце пособия даны приложения, которые, несомненно, облегчат организацию лабораторных занятий.

Пособие адресовано студентам и слушателям медицинских колледжей, а также лабораторным техникам и технологам, работающим в биохимических и клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Макромолекулы, составляющие основу живой

материи – организма человека.

Раздел I

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ ПРИ ПОМОЩИ ЦВЕТНЫХ РЕАКЦИЙ

В лабораторной практике для идентификации, полуко­личественного определения белков и отдельных амино­кислот очень часто используются цветные реакции. В цветных реакциях происходит взаимодействие специ­фических реактивов с функциональными группами ради­калов аминокислот, входящих в состав белков, или с пеп­тидными группировками.

Цветные реакции на белки проводят параллельно с растворами двух белков: яичного белка (I) и желатина (II). Результаты оформляют в виде таблицы.

Форма записи

		Опре-	При-	Результа	ты реак-	Вывод.
№		деляе-	меняе-	ции: нал	ичие (+)	Сравнение
п/п	Реакция	мая	мые	или отсут	ствие (—)	аминокис-
		амино-	реак-			лотного со­става белков
		кислота	тивы	I	II
	Биуретовая
	Ксантолро-
	теиновая
	(нитрования)
	Миллона
	Фоля
	Сакагути

Работа №1. Биуретовая реакция на белки

В щелочной среде раствор белка при добавлении раз­бавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образовани­ем комплексов ионов меди с пептидными группами белка.

Биуретовую реакцию дают все белки, а также олиго-пептиды, содержащие не менее двух пептидных связей.

Материал для исследования* (для выполнения работ №1-5).Яичный белок — 1 % раствор; желатин — 1 % раствор.

Реактивы (для выполнения работ № 1—5).CuS0₄, 1 % раствор; гидроксид натрия, 10 % и 30 % растворы; азотная кислота, концентрирован­ный раствор; аммиак, концентрированный раствор; аце­тат свинца, 5 % раствор; а-нафтанол, 0,1 % спиртовой раствор; гипобромит натрия.

Оборудование.Штативы с пробирками; пипетки; газо­вые горелки; водяные бани.

Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель рас­твора яичного белка, в другую — 5 капель раствора жела­тина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10 % раствора NaOH и по 1 капле 1 % раствора CuS0₄. В обе­их пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.

Оформление работы.Результаты опыта вносят в таб­лицу.