Способы приготовления суспензии Brevundimonas diminuta для валидации процесса стерилизующей фильтрации

1. Используют желатиновый (лиофилизированный) диск (таблетку, гранулу) либо микробную массу со скошенной агаризованной среды (СКА);

2. Асептически вносят в жидкую среду (СКБ) ;

3. Культивируют с аэрацией при темепературе 30-35ºС

4. Критерий приемлемости – титр по окончании культивирования должен составлять 10 9 – 10 10 КОЕ/мл;

5. Режим приготовления суспензии Brevundimonas diminuta для валидации процесса стерилизующей фильтрации устанавливается заранее

Идентификация размера клеток и однородности суспензии Brevundimonas diminuta ? Необходимость процедуры вызвана: - возможностью наличия в суспензии клеток, размеры которых превышают приемлемые значения; - способностью клеток к агрегации.

? Методы:

• Микроскопирование окрашенных по Граму препаратов: - Световой микроскоп, оснащенный калиброванным окуляр-микрометром и масляно- иммерсионным или суховоздушным объективом с высокой разрешающей способностью. - Рассматривают микроорганизмы в нескольких полях зрения для оценки их размеров и расположения. • Фильтрация через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм - 10 мл приготовленной суспензии фильтруют через шприцевые фильтрующие насадки (размер пор 0,45 мкм), фильтрат добавляют в 100 мл СКБ, инкубируют 24 - 48 ч. при температуре 30 – 35 о С с аэрацией. - По истечении инкубации наличие роста (визуальное) свидетельствует о присутствии в приготовленной суспензии микроорганизмов с размером до 0,4 мкм в ширину. - Для подтверждения присутствия в суспензии монокультуры Brevundimonas diminuta проводят микроскопирование мазков, окрашенных методом Грама и методом, позволяющим идентифицировать жгутики. Регистрация приготовления суспензии Brevundimonas diminuta Процедуру приготовления суспензии Вrevundimonas diminuta для валидации стерилизующеей фильтрации, регистрируют в соответствующих протоколах.

Например:

• Протоколе приготовления суспензии Вrevundimonas diminuta;

• Протоколе определения титра жизнеспособных клеток в суспензии Вrevundimonas diminuta; • Протоколе идентификации размера клеток и однородности суспензии Вrevundimonas diminuta. Расчет объёма суспензии Brevundimonas diminuta, обеспечивающего необходимую бионагрузку.

Объём бактериальной суспензии, например, с титром 10 9 , необходимый для проведения валидации стерилизующей фильтрации (удерживающей способности фильтра), рассчитывают исходя из активной площади фильтра и минимальной нагрузки на 1 см 2 этой площади (не менее 10 7 КОЕ/см 2 ). Например, если площадь фильтра – 0,8 м 2 :

Где : 2 7 см / КОЕ 10 ‐ минимальная нагрузка на 1 см 2 активной площади фильтра; 2 4 см 10 8 , 0 ⋅ - активная площадь фильтра (т. е. 0,8 м 2 ); КОЕ/мл 10 9 - титр Brevundimonas diminuta в 1 мл приготовленной суспензии Таким образом, для обеспечения необходимой минимальной нагрузки на фильтр площадью 0,8 м 2 требуется не менее 80 мл суспензии Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta в бульоне на основе гидролизата казеина и соевых бобов с титром 10 9 КОЕ/мл

Расчет бактериальной (предстерилизационной) нагрузки раствора лекарственного средства (модельного раствора) - 80 мл приготовленной суспензии Brevundimonas diminuta с содержанием в 1 мл 10 9 КОЕ вносят в раствор ЛС (10%•V), при этом минимальная нагрузка на 1 см 2 активной площади фильтра составляет 10 7 КОЕ/ см 2 при площади фильтра 0,8 м 2 . - Суммарная нагрузка на фильтр площадью 0,8 м 2 составляет: 80 мл · 10 9 КОЕ/мл= 8 · 10 10 КОЕ. - (10%•V) л приготовленной суспензии Brevundimonas diminuta в растворе ЛС содержит 8 · 10 10 КОЕ культуры Brevundimonas diminuta

- Количество КОЕ в 1 мл приготовленного раствора - бактериальная (предстерилизационная) нагрузка раствора лекарственного средства (модельного раствора) - составляет:

где: ((10%•V)•10 3 мл) – объем раствора ЛС или модельного раствора в мл

Метод определения предстерилизационной нагрузки (титра жизнеспособных клеток в суспензии Brevundimonas diminuta )

- Метод десятикратных разведений в стерильном 0,9% раствор натрия хлорида. Из пробирок с десятикратными разведениями суспензии культуры ( 10 -7 , 10 -8 и 10 -9 ) делают высевы по 0,1 мл суспензии в чашки Петри с агаром на основе гидролизата казеина и соевых бобов. Для каждого разведения используют не менее 2-х чашек Петри. Чашки инкубируют при температуре 30 - 35 о С в течение 48 - 72 ч., после чего проводят учет результатов. - Параллельно осуществляют контроль чистоты культуры. -Число жизнеспособных клеток в 1 мл исходной суспензии рассчитывают следующим образом: х = а·10ⁿ·10, где х – титр клеток (КОЕ/мл), а – среднее число выросших колоний в чашке Петри для каждого разведения, n – степень соответствующего разведения, 10 – коэффициент пересчета для перевода 0,1 мл в 1 мл. Полученное значение должно соответствовать рассчитанному.