Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т.е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Примером такого свечения являются известные всем лампы дневного света, в кото­рых в результате облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав—люминофор, покрыва­ющий изнутри колбу лампы.

Цвет люминесценции обычно смещен в более длинно­волновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция возбуждается синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается невидимым ультрафи­олетовым излучением, то цвет ее может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, погло­щающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микро­скопа в основном следующим:

1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (уль­трафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления). В специальных люминес­центных осветителях, которые устанавливают на обычный микроскоп, применяют кварцевые галогенные лампы (КГМ).

2. Наличие системы светофильтров:

а) возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, кото­рая возбуждает люминесценцию;

б) теплозащитный светофильтр защищает от перег­рева другие светофильтры, препарат и оптику люминес­центного микроскопа в отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию кроме того выпол­няет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполнен­ная дистиллированной водой. Эта кювета установлена непосредственно после коллектора.

При работе с люминесцентным микроскопом надо обращать особое внимание на то, чтобы эта кювета была полностью заполнена водой и чтобы вода была абсо­лютно чистой и прозрачной, поскольку при длитель­ной работе микроскопа в воде могут размножаться микро­организмы и она мутнеет;

в) «запирающие» светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесцен­ции от препарата к глазу наблюдателя.

Рис.5

Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1. Дуговая лампа; 2. Кварцевый коллектор; 3. Кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4. Передняя часть коллектора; 5. Ультрафиолетовый фильтр; 6. Призма; 7. Пластинка из уранового стекла; 8. Окулярный фильтр, поглощающий ультрафиолетовые лучи

В нашей стране разработан очень эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который используется во всех отечественных люминес­центных микроскопах. Этот способ заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую число­вую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Очень важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференцион­ная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив и представляющая собой полупрозрачное зерка­ло, которое избирательно отражает и направляет в объек­тив только ту часть спектра, которая возбуждает люми­несценцию, а пропускает в окуляр только свет люминес­ценции.

Оптика объективов люминесцентного микроскопа изго­тавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква «Л». При работе с объективами масляной иммерсии при люминесцентной микроскопии пользуются специальным нелюминесцирующим иммерсионным маслом.

Правила настройки люминесцентного микроскопа под­робно изложены в инструкции к микроскопу.

Для изучения микроорганизмов в люминесцентном микроскопе их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными растворами специальных люминесцирующих красителей (флюорохромов), которые избирательно связываются с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красите­лей тем, что применяются в очень малых концентрациях (до нескольких мкг/мл); кроме того, ими могут быть окрашены не только фиксироваванные, но и живые клетки. Люминесцентная микроскопия также используется для регистрации результатов реакции иммунофлюоресцеции (РИФ).