Оборудование микробиологической лаборатории
К оборудованию микробиологической лаборатории относятся приборы оптические (микроскопы, лупы), приборы термические (термостаты, автоклавы, аппараты Коха, сушильные шкафы, холодильники, микробиологические (бактериологические иглы, петли, шпатели) и хирургические инструменты (скальпели, пинцеты, держатели, ножницы), а также пробирки, чашки Петри, покровные и предметные стекла, стеклянные трубочки, капельницы с красителями. В лаборатории необходимо наличие питательных сред (сухой питательный агар, среда Кесслер, среда Эндо), агар-агара, желатина, аналиновых красителей (фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, метиленовый голубой), различные кислоты, щелочи, сода.
Для изучения микроорганизмов используется несколько специфических методов. Основными видами микробиологических исследований являются:
- бактериоскопическое (микроскопическое) - изучение с помощью микроскопа формы и строения микроорганизмов;
- бактериологическое - изучение культур микроорганизмов путем культивирования, т.е. выращивания на искусственных питательных средах;
- экспериментальное - определение микроорганизмов и их ядов путем заражений ими подопытных животных (мышей, белых крыс, морских свинок). Чаще всего используется для идентификации возбудителя пищевых отравлений;
- серологическое - определение микроорганизмов при помощи сыворотки крови, содержащей антитела. Этот метод широко используется в медицинской микробиологии.
При микробиологическом анализе пищевых продуктов применяются первые два вида исследований. Методом бактериологического исследования определяют культуральные признаки (размер, форму, структуру, цвет, блеск, профиль отдельной колонии) и биохимические особенности микроорганизмов (способность сбраживать вещество, входящее в состав различных питательных сред). При бактериоскопическом исследовании определяют морфологические особенности (размер, форму и т.д.) отдельных микроорганизмов и их способность окрашиваться различными красителями (тинкториальные свойства). Поскольку в природе существует много микробов-двойников, похожих по внешнему виду друг на друга, поэтому для определения вида микроорганизмов одной бактериоскопии обычно недостаточно, необходимо применение бактериологического метода исследования.
2. Источники инфекции на производстве. Посторонние и вредные микроорганизмы, попадающие в производство, могут понизить качество продукции и увеличить потери. Для своевременного проведения необходимых мероприятий для устранения микроорганизмов необходимо как можно раньше обнаружить источники и очаги инфекции, поэтому на пищевых предприятиях проводиться систематический контроль за микробиологическим состоянием производства. Задача контроля на заводе состоит в наиболее быстром обнаружении инфекции и предотвращении ее развития. Для проведения микробиологического контроля в заводской лаборатории существует микробиологический отдел, оснащенный необходимым оборудованием и аппаратурой.
Инфекция на пищевом производстве означает проникновение и развитие посторонних микроорганизмов. Это микробы опасные для человека (патогенные микроорганизмы) или микроорганизмы, которые представляют угрозу для технологических процессов (вредители производства). Все источники инфекции делят на 2 группы: внутренние и внешние. К внешним источникам относятся воздух, вода, сырье; а к внутренним – воздух в цехах и помещениях, фильтры и фильтрующие материалы, технологические оборудование, тара, руки, одежда и обувь рабочих.
Источником инфекции может быть вода, не удовлетворяющая санитарным требованиям. В соответствии с санитарными нормами в воде не допускается более 100 клеток микробов в 1 мл. Особенно строго регламентируются санитарные нормы для кишечной палочки: если в воде или продукте общее количество микроорганизмов выше, чем разрешено ГОСТом, то использование этой воды или продукта запрещается. При наличии в воде патогенных возбудителей заболеваний ее использование для хозяйственно-питьевых и промышленных целей запрещено.
В зависимости от назначения воды требования к ее биологической чистоте различны. Например, для замочки зерна, варки сусла, сиропов, маринадов используют небезупречную воду. Самые высокие требования предъявляются к воде, используемой для промывки фильтрационных материалов, производственных дрожжей, для мойки технологического оборудования.
В воздухе постоянно содержатся вегетативные клетки микроорганизмов: дрожжей, пигментообразующих бактерий, плесневых грибов. Санитарными нормами установлено, что воздух считается чистым, если в 1 м3 содержится не более 500 клеток микроорганизмов.
На поверхности сырья (плодов, ягод, овощей) находится большое количество различных микроорганизмов. Они составляют эпифитную микрофлору, которая не наносит никакого вреда данному виду сырья. Численность и видовый состав эпифитной микрофлоры меняются в зависимости от вида растения и климатических условий. Характерными представителями эпифитной микрофлоры являются дрожжи, молочнокислые и уксуснокислые бактерии, споры плесневых грибов. Изделия из зерна, а также солод обычно тоже инфицированы эпифитной микрофлорой, среди которой преобладают споры плесневых грибов, молочнокислые бактерии и безвредные кокки.
Производственная культура, применяемая в производстве (дрожжи, молочнокислые бактерии и так далее), также может быть источником инфекции. Первоначально разведенная чистая культура на производствах через 3 – 4 регенерации загрязняется. Причиной загрязнения является недостаточная чистота аппаратуры, недоброкачественная вода, воздух и так далее. Поэтому на производствах проводится микробиологический контроль чистоты производственной культуры, способов ее хранения и обработки.
Технологическое оборудование. Микрофлора проявляется при несвоевременной мойке оборудования и несвоевременном удалении из емкостей остатков продуктов и отходов, которые представляют собой питательную среду для микроорганизмов. В бродильных производствах часто основным источником инфекции являются деревянные емкости. Если микроорганизмы попадают в участки емкости, где отсутствует покрытие, то их уже ничем невозможно уничтожить. В алюминиевых емкостях при плохом уходе и при применении неподходящих дезинфицирующих средств появляются признаки коррозии, на поверхности образуются поры, в которых развиваются микроорганизмы. При небрежном отношении со шлангами и рукавами образуются осадки, которые могут стать средой для развития микробов.
3.Объекты микробиологического контроля на различных предприятиях определяются теми источниками, через которые проникает инфекция. По направленности микробиологический контроль делят на производственный контроль и контроль эффективности дезинфекции. Также проводят санитарно-бактериологический контроль. Производственный контроль охватывает контроль различных технологических стадий производства, разделяется по цехам, в которых контролируются различные объекты в соответствии со схемой контроля для данного производства. В схеме микробиологического контроля на предприятии важен анализ воды и воздуха.
Микробиологический и санитарно-гигиенический контроль. Задачей микробиологического контроля является возможно быстрое обнаружение и выявление путей проникновения микроорганизмов - вредителей в производство, очагов и степени размножения их на отдельных этапах технологического процесса; предотвращение развития посторонней микрофлоры путем использования различных профилактических мероприятий; активное уничтожение ее путем дезинфекции с целью получения высококачественной готовой продукции.
Микробиологический контроль должен проводиться заводскими лабораториями систематически. Он осуществляется на всех этапах технологического процесса, начиная с сырья и кончая готовым продуктом, на основании государственных стандартов (ГОСТ), технических условий (ТУ), инструкций, правил, методических указаний и другой нормативной документации, разработанной для каждой отрасли пищевой промышленности. Для отдельных пищевых производств имеются свои схемы микробиологического контроля, в которых определены объекты контроля, точки отбора проб, периодичность контроля, указываются, какой микробиологический показатель необходимо определить, приводятся нормы допустимой общей бактериальной обсемененности.
Микробиологический контроль будет действенным и будет способствовать значительному улучшению работы предприятия, только если он сочетается с санитарно - гигиеническим контролем, назначение которого - обнаружение патогенных микроорганизмов. Они обнаруживаются по содержанию кишечной палочки. Санитарно - гигиенический контроль включает проверку чистоты воды, воздуха производственных помещений, пищевых продуктов, санитарного состояния технологического оборудования, инвентаря, тары, гигиенического состояния обслуживающего персонала (чистоты рук, одежды и т. п.). Он осуществляется как микробиологической лабораторией предприятия, так и санитарно-эпидемиологическими станциями по методикам, утвержденным Министерством здравоохранения.
В пищевых производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов, необходим систематический микробиологический контроль за чистотой производственной культуры, условиями ее хранения, разведения и т. д. Посторонние микроорганизмы в производственной культуре выявляют путем микроскопирования и посевов на различные питательные среды. Микробиологический контроль производственной культуры, кроме проверки биологической чистоты, включает также определение ее физиологического состояния, биохимической активности, наличия производственно - ценных свойств, скорости размножения и т.п. В тех пищевых производствах, где применяются ферментные препараты, также обязателен микробиологический контроль их активности и биологической чистоты.
Контроль пищевых продуктов. Для оценки качества сырья, полуфабрикатов, вспомогательных материалов, готовой продукции в нашей стране в основном используются два показателя – МАФАМ КоЕ – количество мезофильных аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов колоний образующих единиц и количество бактерий кишечной группы (преимущественно кишечной палочки) МАФАМ определяют в основном чашечным методом. Выполнение анализа включает четыре этапа:
- приготовление ряда разведений из отобранных проб (при обследовании поверхности продукта или оборудования пробу отбирают путем смыва или соскоба с определенной площади);
- посев на стандартную плотную питательную среду (для выявления бактерий - на мясо - пептонный агар в чашки Петри);
- выращивание посевов в течение 24—28 ч в термостате при 30°С;
- подсчет выросших колоний. Число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 мл продукта с учетом разведения. Окончательным результатом будет среднее арифметическое от результатов подсчета колоний в 2 - 3 чашках.
Полученные результаты будут меньше истинного обсеменения продукта, так как чашечным методом учитываются только сапрофитные мезофильные бактерии (аэробы и факультативные анаэробы). Термофильные и психрофильные бактерии не растут из-за несоответствия температуры оптимальной; анаэробы не растут, поскольку выращивание проводится в аэробных условиях; другие бактерии (в частности, патогенные) не растут из-за несоответствия питательной среды и условий культивирования. Не образуют колоний мертвые клетки. Однако эти микроорганизмы можно не учитывать и ошибкой анализа пренебречь, поскольку сапрофиты являются основными возбудителями порчи пищевых продуктов.
В некоторых производствах (консервном, сахарном, хлебопекарном и др.) используются дополнительные микробиологические показатели, например, количество анаэробных, термофильных, спорообразующих и других микроорганизмов, характерных для каждого вида исследуемого объекта. Для их учета имеются специальные методические приемы, описанные в соответствующей нормативной документации. Например, для определения процентного содержания спорообразующих бактерий посев производят из пробирок с разведениями проб, предварительно прогретых несколько минут в кипящей водяной бане. При посевах из прогретых проб вырастают только спороносные бактерии, а из непрогретых - все остальные. Затем рассчитывают процентное содержание спорообразующих форм микроорганизмов. Чем выше показатель МАФАМ, тем больше вероятность попадания в исследуемый объект патогенных микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней и пищевых отравлений. Обычно в 1 г (или 1 мл) продукта, не прошедшего термической обработки, содержится не более 100 тысяч сапрофитных мезофильных бактерий. Если же их количество превышает 1 млн. клеток, то стойкость готового продукта при хранении снижается и его употребление может нанести вред здоровью человека.
Определение бактерий кишечной группы основано на способности кишечной палочки сбраживать лактозу до кислоты и газа. При санитарно - гигиеническом контроле сырья, полуфабрикатов, готовой продукции исследование на наличие бактерий кишечной группы ограничивают проведением так называемой первой бродильной пробы. Бродильную пробу осуществляют путем посева в пробирки со специальной дифференциально-диагностической средой для кишечной палочки (среда Кесслера с лактозой) различных объемов (или навесок) исследуемого объекта - 1,0; 0,1; 0,01; 0,001 мл (или г). Пробирки с посевами .помещают в термостат при 37°С на 24 ч, затем их просматривают и устанавливают бродильный титр, т. е. те пробирки, в которых наблюдается рост (помутнение среды) и образование газа в результате брожения. При отсутствии газообразования объект контроля считают не загрязненным кишечной палочкой. При наличии газообразования производят вычисление коли-титра для различных объектов контроля по специальным таблицам. Существуют нормы допустимой общей бактериальной обсемененности и содержания кишечной палочки в объектах контроля.
4.Методы анализа воды и воздуха. Методы анализа воды. Биологические свойства воды на пищевых предприятиях оцениваются по 2-м показателям:
1) по общей обсемененности (содержание микроорганизмов в 1мл воды);
2) по содержанию бактерий группы кишечной палочки (коли-титр, коли-индекс);
В производствах, основанных на брожении, имеют значение специальные показатели: по Вихману и по Шлезингеру. Они устанавливают содержание в воде микроорганизмов, мешающих жизнедеятельности дрожжей.
Общая обсемененность воды или общее содержание различных видов микроорганизмов в 1 мл воды определяют посевом на мясопептонный или дрожжевой агар с рН 7,2. Если вода визуально чистая, то для посева берут 0,1 и 1 мл воды. Если вода загрязнена, то делают такое разведение, чтобы засеять порции 0,01 и 0,001 мл воды. При таком посеве на одной чашке Петри должно вырасти от 30 до 300 колоний. Посевы помещают в термостат на 24 часа при температуре 37оС.
Анализ воды по Вихману: устанавливают, какое количество воды за определенный период может вызвать изменение сусла. Для проведения анализа в несколько пробирок вносят различное разведение воды и выдерживают при температуре 25оС в течение 5 суток. В течение этого времени наблюдают за появившимися изменениями (наличие мути, осадка, брожения). По шкале в зависимости от скорости изменений определяют качество воды.
Анализ по Шлезингеру аналогичен, но в зависимости от скорости изменений в сусле установлены коэффициенты, при помощи которых вычисляют разрушающее действие воды на сусло, то есть степень влияния микроорганизмов на брожение. Качество воды определяют по шкале.
3. Методы анализа воздуха. Существуют качественные и количественные методы бактериологического исследования воздуха, они основаны на оседании микробных клеток. Качественные методы дают общее представление о нахождении в воздухе микроорганизмов. Самый простой среди них – это метод оседания. Для его проведения чашку Петри с мясопептонным агаром без крышки устанавливают в производственном помещении на 15 минут, затем закрывают и помещают в термостат на сутки при температуре 28 – 30оС. Выросшие колонии подсчитывают невооруженным глазом. Предполагается, что в течение 5 минут на чашку в 100 см2 оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха.
Количественные методы позволяют определить содержание бактерий в определенном объеме воздуха. Основные ,используемые для этого приборы: бактериоловители, мембранные и желатиновые фильтры, прибор Кротова. Прибор Кротова является наиболее совершенным. Через щель прибора проходит струя воздуха, которая удаляется о влажную поверхность питательной среды прибора. Содержащиеся в воздухе микроорганизмы прикрепляются к поверхности мясопептонного агара. Загрязненность выражается количеством жизнеспособных микроорганизмов в 1 м3, выросших на мясопептонном агаре при 37оС за 48 часов.
ЛЕКЦИЯ №11.