Забор мокроты методом провокации

Забор мокроты проводится после провоцирующей отделение мокроты ингаляции. Для ингаляции рекомендуется использовать раствор, в 1 литре стерильной дистиллированной воды которого содержится 150 гр. NaCl и 10 гр Na2CO3 (двууглекислый натрий). Больной вдыхает за процедуру 30-60 мл данной смеси в течение 10-15 минут. После ингаляции усиливается отделение слюны еще до появления кашля, поэтому первую порцию слюны предлагается больному сплюнуть в специальный лоток с хлорамином, а затем собирать мокроту.

Забор промывных вод бронхов.

Промывные воды бронхов забираются у пациентов при отсутствии мокроты, невозможности проведения аэрозольной ингаляции или при безуспешности их.

Забор промывных вод бронхов осуществляет врач-отоларинголог или они забираются при проведении бронхоскопии. При этом во время вдоха вводят в трахею 5-7 мл стерильного изотонического раствора, в результате вызывается кашлевой рефлекс, и промывные воды бронхов собираются в стерильный флакон. У лиц с выраженным глоточным рефлексом при проведении процедуры рекомендуется предварительная анестезия надгортанника, гортани, задней стенки глотки.

Забор промывных вод желудка:

- промывные воды желудка забираются у детей младшего возраста, так как они плохо откашливают мокроту и проглатывают ее;

- мокрота забирается натощак, последний прием пищи должен быть не меньше, чем за 12 часов до взятия промывных вод желудка;

- больному дают выпить 100-150 мл раствора питьевой соды для нейтрализации желудочного содержимого. Для приготовления раствора питьевой соды берут 1 чайную ложку соды на 1 стакан стерильной дистиллированной, а не водопроводной воды, для исключения попадания в желудок кислотоустойчивых сапрофитов;

- больному вводят в желудок желудочный зонд и собирают содержимое желудка в специальный стерильный флакон, который быстро доставляют в лабораторию.

Имеются данные, что наиболее результативен в выявлении МБТ метод, включающий сочетание аэрозольных ингаляций с промывными водами желудка, которые должны забираться через 30 минут после ингаляции. В этом случае повышается процент положительных результатов выявления МБТ.

Забор операционного материала осуществляется в стерильные флаконы без консервантов с немедленной доставкой в лабораторию. Возможно хранение в холодильнике при температуре 4-10°С с небольшим количеством стерильного физиологического раствора или сухим льдом при невозможности быстрой доставки.

Забор анализа мочи на МБТ:

- забирается средняя утренняя порция мочи или вся утренняя порция с последующей доставкой в бактериологическую лабораторию;

- при невозможности быстрой доставки материал не должен храниться в холодильнике больше 48-72 часов, если больше, то добавляются консерванты: 2-3% раствор борной кислоты (срок хранения до 3 суток при комнатной температуре), 0,05-0,1% раствор хлоргексидина биглюконата (срок хранения 3-5 суток).

К микробиологическим методам диагностики туберкулеза относят:

1) бактериоскопический ;

2) бактериологический;

3) биологический;

4) молекулярно-биологический метод.

Из перечисленных выше, самым чувствительным методом выявления МБТ является биологический метод, его чувствительность составляет 1-5 микробных тел в 1мл исследуемого материала; на 2 месте - бактериологический метод (чувствительность - 20-100 микробных тел в 1 мл); на 3 месте – бактериоскопический метод (чувствительность более 100 тыс. и более микробных тел в 1 мл). Золотым стандартом выявления больных туберкулезом является сочетание бактериоскопического и бактериологического методов. Биологический метод более дорогой и используется в трудных диагностических случаях.

Разновидностями бактериоскопического метода являются:

- простая бактериоскопия с окраской по Цилю-Нильсену: вначале препарат обрабатывают карболовым раствором фуксина, затем обесцвечивают 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта и докрашивают 0,25% раствором метиленового синего. МБТ выглядят под микроскопом в виде красных палочек на синем фоне (приложение 2, рис. 2);

- люминесцентная микроскопия с применением флюорохромов: аурамин 00, родамин С и другие. Под люминесцентным микроскопом МБТ выглядят в виде желто-зеленых светящихся палочек на черном фоне. При использовании люминесцентной микроскопии информативность метода повышается на 30% (приложение 2, рис.3).

- метод седиментации, метод флотации повышают информативность микроскопического метода на 10%.

Бактериологический (культуральный) метод заключается в посеве мокроты на питательные среды. Стандартной питательной средой для выращивания МБТ служит твердая яичная среда Левенштейна- Йенсена. Существуют так же жидкие питательные среды (система ВАСТЕТ 460 ТВ и др.). Посевы длительно выдерживают в термостате при температуре 37-38°С. Рост колоний на твердых питательных средах происходит за 14-90 дней, на жидких -3-14 дней. Для МБТ человеческого и бычьего видов характерно образование плотных морщинистых колоний кремового цвета (приложение 2, рис. 4).

Преимущества данного метода:

- данным методом можно определить жизнеспособность культуры (способность размножаться, способность к образованию и росту колоний). Если микобактерии туберкулеза выявляются при простой микроскопии, но при посеве роста колоний не наблюдается, то это нежизнеспособные МБТ (образно говоря «микобактерии туберкулеза-трупы»);

- можно определить степень вирулентности МБТ. Быстрорастущие колонии МБТ, это, как правило, более вирулентная культура;

- можно дать количественную характеристику бактериовыделения. Если у больного выявляется при посеве от 1-20 колоний, то это свидетельствует о скудном бактериовыделении; от 21 до 100 колоний - умеренное бактериовыделение; более 100 колоний – обильное бактериовыделение.

Пациенты с обильным бактериовыделением более опасны для окружающих в плане заражения;

- можно определить чувствительность МБТ к противотуберкулезным препаратам и выявить лекарственную устойчивость. Основными методами определения лекарственной чувствительности МБТ являются методы абсолютных концентраций (применяется в России) и пропорций (применяется за рубежом). По своей информативности они равноценны. У больных туберкулезом можно выявить следующие виды лекарственной устойчивости МБТ к применяемым противотуберкулезным препаратам:

1) первичная лекарственная устойчивость – если больной вообще не принимал противотуберкулезные препараты или принимал их менее 3 недель, то есть он заразился изначально лекарственно-устойчивыми штаммами МБТ. Первичная лекарственная устойчивость характеризует состояние микобактериальной популяции на данной территории и важна для эпидемической характеристики заболеваемости;

2) вторичная лекарственная устойчивость – если больной принимал противотуберкулезные препараты более 3 недель и лекарственная устойчивость у него сформировалась в результате неэффективной и неадекватной химиотерапии;

3) множественная лекарственная устойчивость – если выявляется устойчивость как минимум к сочетанию изониазида и рифампицина, независимо от наличия или отсутствия лекарственной устойчивости к другим препаратам;

4) поливалентная лекарственная устойчивость- выявление лекарственной устойчивости к препаратам основной группы и резервным;

5) монорезистентность - выявление устойчивости к одному препарату;

6) перекрестная лекарственная устойчивость – выявление лекарственной устойчивости к препаратам одной группы по происхождению (например, группа аминогликозиды: стрептомицин, канамицин).

Важно отметить, что в последние годы отмечается рост лекарственноустойчивых форм туберкулеза среди взрослого населения.

В настоящее время за рубежом и в последние годы в России для выявления живых МБТ применяется радиометрическая система ВАСТЕТ. МБТ культивируют в жидкой питательной среде, где в качестве источника углерода используется меченая 14С пальмитиновая кислота. Преимуществом новой микробиологической методики является возможность быстрого получения результата исследования – через 12-24 дня. К недостаткам этого метода, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся:

- высокая себестоимость исследования;

- необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радиометрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией;

- необходимость дополнительного посева на плотную питательную среду при возникновении проблем с идентификацией возбудителя или интерпретации результатов. Данная методика не дает качественной характеристики возбудителя и не позволяет определить лекарственную чувствительность возбудителя.

Биологический метод заключается в заражении морских свинок мокротой или другим патологическим материалом, предварительно обработанным серной кислотой для уничтожения неспецифической микрофлоры. Исследуемый материал вводится подкожно в паховую область, яичко, внутрибрюшинно. Ежедневно животному вводится кортизон для снижения иммунитета. При положительном результате через 1 месяц у животного формируется генерализованный туберкулез, животное забивают и выделенные органы исследуют макроскопически, гистологически и бактериологически. Биологический метод применяется для выявления не только типичных, но и биологически измененных форм возбудителя, в частности L- трансформированных и фильтрующихся форм.

Иммуноферментный анализ. Впервые его применил для выявления противотуберкулезных антител Е. Nassau в 1976 году. Он использовал в качестве антигена фильтрат M. tuberculosis H37Rv. Преимуществами данного метода являются:

- высокая производительность метода;

- простота в проведении анализа и регистрации результатов;

-возможность использования микроколичества диагностического

материала;

- быстрый метод;

- легко автоматизируется;

- более безопасен и экономичен по сравнению с радиоиммунологическим

методом;

- специфичность метода (частота отсутствия реакции на препарат у здоро

вых лиц) колеблется от 86-97%, чувствительность метода (частота положи

тельных ответных реакций у лиц с активной туберкулезной инфекцией) -

от 68-92%.

Молекулярно-генетические методы обнаружения М. tuberculosis основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод известен с 1985 года и сущность его состоит в выявлении в составе биологического материала фрагментов цепи ДНК или РНК, специфических для данного возбудителя. Для поиска возбудителя используют различный патологический материал (мокроту, промывные воды трахеи, бронхов, плевральную, спинномозговую жидкость и другие объекты). Принцип метода состоит в циклическом повторении трех стадий реакции:

1) денатурации ДНК при нагревании;

2) гибридизации искусственно синтезированных олигонуклеотидов с фланговыми участками цепей амплифицируемого фрагмента ДНК (так называемых «праймеров» или «затравочных» фрагментов);

3) синтеза (достройки) цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Многократное удвоение цепей ДНК (30-40 циклов) позволяет в течение нескольких часов умножить (амплифицировать) специальный участок ДНК в геометрической прогрессии, а затем идентифицировать его (при электрофорезе в агарозном геле в присутствии красителя этидия бромида синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы).

Преимущества метода:

- метод обладает высокой чувствительностью (теоретически можно определять единичные М. tuberculosis в образце). По сравнению с культуральными методами, при обследовании больных туберкулезом методом ПЦР число положительных результатов увеличивается на 50-70%.

- быстрота проведения анализа (1-2 дня), что чрезвычайно ценно для клинической практики.

- данный метод позволяет значительно улучшить распознавание этиологии патологического процесса у пациентов без выделения микобактерий.

- информативен при дифференциальной диагностике туберкулезного плеврита, менингита, мочеполового туберкулеза.

- эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (в том числе L-форм), определение которых требует длительного культивирования и сложных питательных сред.

- перспективен при дифференциации М. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий (в том числе и после культивирования микобактерий, особенно на жидких питательных средах с использованием систем типа BACTEC).

- перспективен для быстрого определения лекарственной устойчивости и, следовательно, необходим для своевременной коррекции лечения (Gene Xpert MTB/RIF (R ) – получение результата через 90 мин, ТБ –Биочип ( HR Fq) - 24 ч, ДНК – стриповый Hain Lifescience ( HRE Fq Am/Сm)- 5ч).

- имеется возможность штаммовой идентификации, что позволяет определять внутривидовые различия возбудителя туберкулеза и представляет интерес для эпидемиологических исследований и определения роли суперинфекции при рецидивах туберкулеза.

Недостатки метода:

- проблема специфичности ПЦР в диагностике туберкулеза обусловлена высоким риском ложноположительных результатов, поскольку продукты амплификации (фрагменты ДНК) легко могут попасть в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций. Это определяет очень жесткие требования к технологии проведения анализов, в том числе раздельные помещения для каждой из трех стадий анализа. Проблема может быть решена за счет инактивации загрязняющих молекул специальными реагентами и совершенствования технологии подготовки клинических образцов (выделение ДНК на микропористых частицах стекла, иммуномагнитная сепарация микобактериий и пр.

- метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.

В связи с этим, использование методов, основанных на амплификации фрагментов генома микобактерий (ПЦР), допускается в России как дополнительный метод ускоренной дифференциальной диагностики туберкулеза для получения ориентировочных результатов при обязательном параллельном применении классических микробиологических методов.

Молекулярно-биологические методы могут проводиться в лабораториях краевых, областных и крупных городских противотуберкулезных учреждений, использующих учрежденные Минздравом России наборы реагентов (тест-системы) и имеющих лицензию на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Технология проведения ПЦР приводится в описаниях и инструкциях соответствующих наборов (тест-систем).