Бактериологические методы исследования. выделение чистых культур бактерий

ЗАНЯТИЕ 1

▲ План

▲ Программа

1. Метаболизм аэробных и анаэробных бактерий.

2. Питательные среды, применяемые для культивирова­ния: их типы, компоненты сред и роль отдельных ингредиентов в жизнедеятельности различных микро­организмов.

3. Понятие о чистой культуре и методы ее выделения; I этап выделения чистой культуры.

4. Особенности культивирования анаэробов, специаль­ные питательные среды.

▲ Демонстрация

1. Выпускаемые промышленностью образцы питатель­ных сред.

2. Готовые питательные среды в разных формах: мясо-пептонный агар (МПА) в чашке Петри, столбик и скошенный агар; мясопептонный бульон (МПБ) в про­бирке; сахарный бульон в пробирке и в колбе; кровя­ной агар в чашке Петри; среда Китта—Тароцци в пробирке; среда Вильсона—Блера (железосульфитный агар) в пробирке; молоко в пробирке; тиогликолевый агар в пробирке; трубка Вейнберга с агаром; анаэрос-тат.

3. Техника посева исследуемого материала петлей и шпа­телем на чашку Петри с плотной питательной средой с целью получения изолированных колоний.

А Задание студентам

1.Ознакомиться с питательными средами и основными ингредиентами для их изготовления.

2. Выполнить I этап выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала, содержащего смесь бакте­рий:

а) приготовить мазок из исследуемого материала и
окрасить его по методу Грама, микроскопировать,
оценить морфологию присутствующих бактерий и
их концентрацию;

б) засеять материал на чашку Петри с МПА, нанося
материал петлей и последовательно распределяя его
шпателем;

в) наметить ход дальнейшего исследования по выде­
лению чистых культур аэробных бактерий.

ЗАНЯТИЕ 2

Программа

1. IIэтап выделения чистых культур аэробных бактерий.

2. Особенности культивирования анаэробов; характер роста анаэробов на специальных питательных средах.

Демонстрация

1. Различные типы колоний аэробных бактерий.

2. Рост чистых культур анаэробов на средах Китта—Та-роцци, Вейнберга, Вильсона—Блера, молоке и тио-гликолевом бульоне.

3. Техника отсева культуры из колоний на скошенный агар.

А Задание студентам

1. Выполнить II этап выделения чистой культуры аэро­
бов из материала, содержащего смесь бактерий:

а) учесть результаты посева исследуемого материала
на чашке Петри с МПА, отметить наличие или
отсутствие колоний, в случае неудачи проанализи­
ровать ее причины;

б) определить, сколько типов колоний имеется на
чашке, и зарисовать их;

в) описать по принятой схеме колонии всех типов;

г) приготовить мазки из колоний каждого типа и ок­
расить их по методу Грама, микроскопировать и
занести данные в протокол;

д) произвести отсев чистой культуры из колонии каж­
дого типа на скошенный агар;

е) наметить план дальнейшей работы.

2. Составить план выделения чистой культуры анаэро­
бов.

А Методические указания

Основные среды.Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде; состав (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05; натрия хлорид — 4,95.

Питательный агар. Состав (г/л): ферментативный гид­ролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар — 12,5; натрия хло­рид - 5,5; рН 7,3+0,1.

Основные сложные среды —кровяные, сывороточные и асцитические. Их готовят путем добавления к питательному агару 5—10 % дефибринированной крови или сыворотки кро­ви либо 25 % асцитической жидкости. Для приготовления жидкой среды такие же количества сыворотки или асцитичес­кой жидкости добавляют к питательному бульону.

Агар Мюллера-Хинтон (основная плотная питатель­ная среда для определения чувствительности бактерий канти­биотикам методом дисков): на 1 л дистиллированной воды 300 г мясного настоя (из говядины), 17,5 г гидролизата казеина, 1,5 г крахмала, 17 г агар-агара.

Элективные питательные среды.Пептонная вода 1 %, рН 8,0. Избирательная для холерного вибриона, который раз­множается быстро, опережая рост других микроорганизмов. Щелочная реакция среды не препятствует росту возбудителя холеры Vibrio cholerae, но тормозит рост других микроорганиз­мов.

Щелочной агар (плотная среда): питательный агар, рН 7,8, аналогично предыдущей среде элективен для V.cholerae.

Среда Леффлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для возбудителя диф­терии Corynebacterium diphtheriae.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Содержит повы­шенные концентрации хлорида натрия (8—10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает элективность среды для данных микроорганизмов. Среда по­зволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие ле-цитиназу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком во­круг колоний лецитиназоположительных видов (фермент рас­щепляет лецитин куриного желтка, который вносится в рас­плавленный и остуженный до 45 °С питательный солевой агар).

Среды длякультивирования анаэробов. Среда Вильсо­на—Блера (железосульфитный агар). Готовится из питательного агара, к которому добавляют глюкозу, Na₂S0₃, FeCl₂. Анаэробные клостридии (C.perfringens) на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления Na₂S0₃ в Na₂S, который, соединяясь с хлоридом железа, дает осадок сульфида железа (FeS) черного цвета.

Среда Китта —Тароцци. Состоит из питательного буль­она, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают в тече­ние 10—15 мин на кипящей водяной бане для удаления возду­ха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелино­вого масла.

Тиогликолевый бульон с гемином (жидкая электив­ная среда для культивирования неспорообразующих анаэро­бов — представителей родов Bacteroides, Prevotella, Porphyro-monas): на 1 л дистиллированной воды 17 г гидролизата казеи­на, 3 г соевого гидролизата, 6 г глюкозы, 2,5 г хлорида натрия, 0,5 г тиогликолата натрия, 0,25 г L-цистеина, 0,1 г сульфата натрия, 5 мг гемина.

Дифференциально-диагностические среды.Среды Гисса. К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика­тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении угле­водов. Среда при рН 7,2—7,4 бесцветна. При разложении уг­леводов она приобретает красный цвет.

Среда Ресселя. Применяется при изучении биохими­ческих свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл). Содер­жит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромти-моловый синий. Приготавливают в пробирках по 6—8 мл в виде столбика со скошенной поверхностью. Цвет незасеянной среды травянисто-зеленый. Посев делают штрихом по скошен­ной поверхности и уколом в глубину столбика. Микроорганиз­мы, ферментирующие глюкозу до кислоты, вызывают измене­ние окраски столбика среды из первоначальной травянисто-зе­леной в желтую; скошенная поверхность при этом приобретает синий цвет. Лактозоположительные микроорганизмы (Е. coli) изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый. Микроорганизмы, образующие щелочь, изменяют цвет среды в синий. Газообразование отмечается в толще столбика среды.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который со­стоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы и индикатора — основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или бледно-ро­зовая. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блес­ком; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные ко­лонии.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, брилли­антовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными со­лями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда явля-

ется не только дифференциально-диагностической, но и селек­тивной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (ки­шечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некото­рых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, пара-тифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные — красные.

Висмут-сульфит агар. Выпускается в сухом виде; со­держит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неоргани­ческие соли, бриллиантовый зеленый, агар. Среда предназна­чена для выделения сальмонелл. Дифференцирующие свойства среды основаны на способности микроорганизмов продуциро­вать H₂S, который вступает в реакцию с цитратом висмута и образует соединение черного цвета — сульфит висмута. Среда резко угнетает рост сопутствующей микрофлоры за счет инги-бирующего действия бриллиантового зеленого и сульфита на­трия.

Техника посевов и пересевов культур микроорганизмов.Уни­версальным инструментом для производства посевов является бактериологическая петля (металлическая многоразовая или пластмассовая одноразовая). Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериологическую иглу, а для по­севов на чашки Петри — металлические, стеклянные или плас­тиковые шпатели. Для посевов жидких материалов наряду спетлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплав­ких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их по­мещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

Все манипуляции с микробами осуществляют с помощью стерильных инструментов вблизи пламени горелки. Металли­ческую бактериологическую петлю перед использованием, по­сле каждой манипуляции и по окончании работы стерилизуют путем прокаливания в пламени горелки.

Культивирование микробов осуществляют посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях температуры, влажности, газового состава атмосферы и т.д. С этой целью материал, содержащий микроорганизмы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие или на плотные среды. В последнем случае посев может быть произведен как на поверхность, так и в глубину агара уколом. Предварительно посуду (пробирку, чашки Петри и др.) надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследова­ния или название культуры). В зависимости от техники посева

и концентрации микробов в посевном материале бактерии на поверхности плотной питательной среды могут давать равно­мерный сплошной рост — бактериальный газон, "сливной рост" (возникает при помещении большого количества микро­организмов на ограниченный участок поверхности агара) или образовывать изолированные колонии.

Техника посева материала на плотную питательную среду.Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического ра­зобщения микробов при посеве. С этой целью материал, взя­тый петлей, наносят на поверхность агара параллельными штрихами, чем достигается последовательное уменьшение кон­центрации бактерий вплоть до единичных клеток. Для сниже­ния концентрации бактерий можно также зигзагообразными движениями густо нанести материал на небольшой участок агара в верхней части чашки Петри, после чего петлю стери­лизуют, а материал распределяют параллельными штрихами по остальной части среды.

Другой способ состоит в приготовлении суспензии с малой концентрацией бактерий. Одну каплю такой суспензии нано­сят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают стерильным шпателем в среду, равномер­но распределяя материал по всей ее поверхности.

Получение бактериального газона. Посевы "га­зоном" производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питатель­ного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, ос­тужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают мате­риал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Получение сливного роста. В пробирку со скошен­ным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным дви­жением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив.

Техника стерильной работы с пробиркой и бактериологи­ческой петлей описана в теме 2.1.

Выделение чистых культур бактерий (ЧК)

Iэтап — получение изолированных колоний бактерий из исследуемого материала. При выделе­нии ЧК бактерий из испытуемого материала первоначально необходимо оценить концентрацию бактерий в материале. На I этапе выделения ЧК также осуществляют первоначальную идентификацию бактерий по морфологии и тинкториальным свойствам. Для решения этих задач из исследуемого материала

готовят фиксированный мазок, окрашивают по методу Грама (или другими методами в зависимости от цели исследования) и микроскопируют. Если количество бактерий в поле зрения велико, исследуемый материал разводят в пробирке со стериль­ным изотоническим раствором хлорида натрия. При малом количестве бактерий в препарате весь объем образца засевают на жидкие среды обогащения с целью увеличения концентра­ции бактерий. При необходимости выделения определенного вида бактерий посев осуществляют на элективные среды.

Для выделения ЧК бактерий из испытуемого материала необходимо сначала разобщить находящиеся в нем микробы разных видов. Обычно для этого посев материала производят на плотную питательную среду таким образом, чтобы получить изолированные колонии присутствующих в нем бактерий (см. выше). После посева чашку переворачивают дном кверху, под­писывают и помещают в термостат при 37 °С на 18—24 ч.

Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который заключается в перемешивании различных разведений исследу­емого материала с расплавленным и остуженным питательным агаром в колбе или пробирке. После этого агар разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате.

Разделение бактерий с использованием физических и химичес­ких факторов осуществляют следующим образом. Для выделе­ния спорообразующих бактерий уничтожают неспорообразую-щие, прогревая исследуемый материал при 80 "С в течение 20 мин или подвергают кратковременному кипячению. Споры бактерий при этом сохраняются и при посеве прогретого ма­териала на питательную среду прорастают. Если материал со­держал только один вид спорообразующих бактерий, таким образом можно получить ЧК. Если материал содержал споры разных бактерий, дальнейшее выделение осуществляют стан­дартными методами.

При выделении ЧК психрофильных бактерий используют инкубацию при низких температурах, задерживающих рост со­путствующей микрофлоры. Так, например, для выделения ЧК возбудителя чумы {Yersinia pestis) посевы инкубируют при тем­пературе около 5"С.

В ряде случаев ЧК бактерий можно получить путем подав­ления размножения части микробов в исследуемом материале воздействием на них факторами, к которым выделяемый вид устойчив. С этой целью используют антимикробные препара­ты, химические вещества и бактериофаги. В питательную среду вносят соответствующее вещество или фаг в строго определен­ной концентрации, препятствующей размножению сопутству­ющих бактерий, но не оказывающей выраженного ингибиру-ющего действия на исследуемый микроорганизм.

Кроме упомянутых, в бактериологической практике иногда применяют и другие методы. Например, для выделения чистой

культуры бактерий рода Proteus (Proteus vulgaris) используют его способность к "ползучему" росту (метод Шукевича). При этом бактерии, засеянные в основание скошенного агара, за время культивирования распространяются по всей поверхности агара.

II этап — накопление ЧК для ее дальнейшей идентификации. II этап начинают с оценки результатов первичного посева материала и изучения кулыпуралъных при­знаков выросших бактерий — особенностей их роста на пита­тельных средах.

Морфология микробных колоний является наиболее ин­формативным культуральным признаком. Колонии различают­ся по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности (рис. 3.1.1). По величине колонии могут быть крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2—4 мм) и малые (1—2 мм), по форме — круглые, розеткооб-разные, листовидные и т.д. Цвет колонии зависит от выработки определенного пигмента — белого, желтого, красного и др. Ко­лонии непигментирующих бактерий бесцветны. По консистен­ции различаются сухие, влажные, сочные или слизистые коло­нии. Поверхность колонии бывает гладкой, морщинистой, ис­черченной, плоской, выпуклой, вдавленной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахромчатым. Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю струк­туру.

При получении микробного газона характер роста бактерий может быть сухим, влажным, "ползучим", складчатым, пиг­ментированным. В жидкой питательной среде одни бактерии дают диффузное помутнение, другие характеризуются придон­ным или пристеночным ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности среды, другие — осадок на дне пробир­ки, что преимущественно определяется потребностью в кисло­роде.

Для оценки результатов первичного посева исследуемого материала чашки с посевами просматривают и изучают мор­фологию выросших колоний. Для определения морфологии бактерий и их тинкториальных свойств из материала колоний разных типов готовят мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Необходимо помнить, что родственные бак­терии могут отличаться по морфологии колоний и наоборот. Материал из изолированной колонии каждого типа пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засевают штрихом на скошенную поверхность агара в пробирку. Для выделения и накопления чистой культуры выбирают колонии только тех бактерий, которые присутствовали в исследуемом материале. Появление колоний других бактерий может быть результатом контаминации (загрязнения) посева посторонними микробами

Рис.3.1.1. Типы бактериальных колоний, а — круглые с ровными краями; б — круглые, выпуклые, блестящие, слизистой консистенции; в — с неровными краями; г — круглые с валиком по периферии; Д — зернистые; е — плоские листовидные; ж — ветвистые; з — складчатые.

вследствие недостаточно строгого соблюдения стерильных ус­ловий работы.

Особенности культивирования анаэробных бактерий.Все ма­нипуляции со строгими анаэробами должны осуществляться в бескислородных условиях. Для этого используют герметичные настольные камеры с регулируемым газовым составом среды. Посевы производят на специальные обогатительные (электив­ные) среды для анаэробов (тиогликолевую, Китта—Тароцци). Посевы инкубируют в специальных С0₂-инкубаторах или в анаэростатах (металлических или пластмассовых контейнерах, герметично закрывающихся крышкой, снабженной патрубками для заполнения газовой смесью нужного состава), которые помещают в обычный термостат. Для инкубации небольших по объему посевов (1—2 чашки Петри) применяют пластиковые пакеты, содержащие химические генераторы газовой смеси, которые обеспечивают полное удаление кислорода из воздуш­ной среды в течение нескольких минут.