Определение содержания железа и ОЖСС в сыворотке крови
Определение содержания железа в сыворотке крови по цветной реакции с батофенантролином.
Реактивы:
Трихлоруксусная кислота, 20% раствор; уксуснокислый аммоний, 70% раствор; насыщенный раствор сульфата гидразина (2,5г соли растворяют в 100мл воды); раствор батофенантролина; стандартный раствор.
Оборудование:
Штатив с пробирками, пипетки на 1,0; 2,0; 5,0 мл, водяная баня на 100°С, центрифуга лабораторная, фотоколориметр.
Материал. Сыворотка, не содержащая следов гемолиза.
Метод основан на способности бато-фенантролина в сульфатированной форме образовывать с ионами двухвалентного железа окрашенный комплекс, интенсивность которого определяется фотометрически.
Ход определения. К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды, 1,5 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 минут на водяную баню при температуре 90-95˚С. Центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и отбирают 4 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 0,35 мл 70% раствора ацетата аммония и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете 10 мм. Затем добавляют 0,4 мл раствора сульфонированного бато-фенантролина, оставляют стоять на 1 час, после чего фотометрируют при тех же условиях. Фотометрию проводят против контрольной пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки вносят 2 мл воды.
Калибровку проводят так же как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл стандартного раствора.
Расчет проводят по формуле:
Еоп-1 – Еоп-2
——————— ∙30 (мкмоль/л)
Ек-1 – Ек-2
где Еоп-1 и Еоп-2 – экстинкции опытной пробы до и после прибавления раствора бато-фенантролина;
Ек-1 – Ек-2 – результаты фотометрии калибровочной пробы;
30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.
Примечание.
1. Железо определяется в сыворотке без следов гемолиза.
2. Следить за содержанием в дистиллированной воде и реактивах, лучше использовать бидистиллированную воду.
3. Посуду следует промывать 5н раствором соляной кислоты и ополаскивать бидистиллированной водой.
4. При взятии крови на анализ больной не должен принимать препаратов железа по меньшей мере в течение 5 дней.
Оформление работы. Рассчитать содержание железа по представленной формуле и сделать вывод его в соответствии норме.
Практическое значение работы. В норме содержание негеминового железа у мужчин 12-32 мкмоль/л, у женщин – на 10-15% ниже.
Содержание железа сыворотки значительно снижается при железодефицитной анемии, независимо от причины ее вызывающей. При воспалительных, инфекционных, септических состояниях, интоксикации, опухолях анемии обусловлены не столько дефицитом железа, сколько его недостаточным освобождением из РЭС, вследствие чего снижается синтез гемоглобина.
Определение содержания железа в сыворотке крови с использованием биотеста «Lachema»
Реактивы:
Железо (2+)-аммония сульфат (77,9ммоль/л), батофенантролин (0,46моль/л), тиогликолевая кислота (92,1моль/л), депротеинизирующий раствор (трихлоруксусная кислота 0,6моль/л, хлористоводородная кислота 2моль/л); реакционная смесь (состоит из батофенантролина 0,23моль/л, тиогликолевой кислоты 95,5моль/л, трихлоруксусной кислоты 0,15моль/л, хлористоводородной кислоты 0,5моль/л, натрий уксуснокислый 1,0моль/л), калибровочный раствор (в мерную колбу емкостью 100мл внести 3мл тиогликолевой кислоты и до метки долить депротеинизирующим раствором, профильтровать при наличии помутнения; раствор устойчив 2 месяца в темном флаконе).
Оборудование.
Штатив с пробирками, пипетка на 1мл, центрифуга, ФЭК.
Материалы:
Сыворотка крови.
Метод основан на взаимодействии ионов двухвалентного железа с батофенантролином с образованием комплекса и развитием окрашивания, интенсивность которого определяется фотометрически.
Ход определения.
В опытную пробирку внести 1мл рабочего раствора и 1мл сыворотки, стандартную-0,5мл рабочего раствора и 0,5мл стандартного раствора, контрольную-0,5мл рабочего раствора и 0,5мл дистиллированной воды. Перемешать, оставить стоять на 5 минут и центрифугировать в течение 10 минут при 3000 об/мин.
В чистую пробирку отобрать 1мл супернатанта и ко всем растворам (супернатант, контроль, стандарт) добавить 1мл батофенантролина, перемешать и в интервале 5-60 минут измерить оптическую плотность опытной пробы (А1) и стандарта (А2) против контрольного раствора на ФЭКе при длине волны 510-550нм в кювете на 1см.
Расчет:
Железо=17,90*А1/А2 мкмоль/л.
Определение общей железосвязывающей способности сыворотки крови (ОЖСС) с использованием набора «Биотест Lachema».
Реактивы:
Хлорид железа (3+) 1,79 ммоль/л, магния карбонат; вспомогательные реактивы те же, что и для определения железа в сыворотке крови; рабочий раствор (реактив хлорида железа развести дистиллированной водой в 20 раз с конечной концентрацией 89,5 мкмоль Fe3+ ионов/л), устойчив в течение месяца при температуре +15…+25°С.
Оборудование:
Мерная ложечка, штатив с пробирками, пипетка на 1мл, центрифуга, ФЭК.
Материалы:
Сыворотка крови.
Метод основан на насыщении сыворотки крови раствором ионов трехвалентного железа, избыток которых устраняется адсорбцией карбонатом магния, а общее содержание железа в сыворотке (общая связывающая способность сыворотки крови) определяется, как изложено выше.
Ход работы:
К 1мл сыворотки крови в пробирке для центрифугирования добавить 2мл рабочего раствора, перемешать и оставить на 5 минут. Мерной ложечкой добавить примерно 0,20-0,25г карбоната магния, перемешать 15сек, и выдержать 30 минут, периодически перемешивая. Центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин. 1 мл прозрачного супернатанта обработать способом, указанным в работе по определению содержания железа.
Расчет:
ОЖСС – 53,71*А1/А2=мкмоль/л.
Примечание.
При одновременном определении содержания железа в сыворотке крови и ОЖСС можно использовать 1мл супернатанта, полученного при проведении работы «Определение содержания железа в сыворотке крови». Далее определение ведется параллельно и можно пользоваться одним общим контрольным раствором и стандартом.
Практическое значение работы.
В норме железо содержится:
Мужчины: 14,3-26,0 мкмоль/л, женщины: 10,7-21,5 мкмоль/л, а Fe ОЖСС составляет 44,8-71,6 мкмоль/л.
Дефицит железа в организме может быть обусловлен кровопотерями, недостаточным поступлением и всасыванием в пищеварительном тракте.
Вначале уменьшаются запасы железа, затем снижается концентрация сывороточного железа, повышается уровень ОЖСС, который носит компенсаторный характер, и ненасыщенной железосвязывающей способности сыворотки крови (НЖСС) – отражает то дополнительное количество железа, которое в определенных условиях может связаться трансферрином.
В целом трансферрины насыщены железом только на 20-50% (в среднем на 1/3) своих возможностей. Критическим считается насыщение трансферрина железом менее чем на 16-17%.
При воспалительных, инфекционных, септических состояниях, интоксикации, опухолях анемия обусловлена не столько дефицитом железа, сколько его недостаточным освобождением из РЭС, вследствие чего снижается синтез гемоглобина, уменьшается ОЖСС и НЖСС.
В отличие от железодефицитных гипохромных анемий, характерной особенностью приобретенных и наследственных железодефицитных анемий является нарушение включения железа в протопорфирин.