Клинико-диагностическое значение определения общей активности ЛДГ и ее изоферментов

В связи с тем, что фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях, констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внут­ренних органов.

Повышение активности лактатдегидрогеназы. Активность ЛДГ в сыво­ротке крови возрастает у больных, страдающих анемией (гемолитической, пернициозной, мегалобластной, серповидно-клеточной), обширным кар-циноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными забо­леваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к ци­толизу и утрате цитоплазмы (этот фермент, широко представленный в тка­нях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических про­цессах в клетках).

При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови увеличена в первые недели желтушного периода, процент мочевиностабильной фракции ЛДГ падает (менее 20).

Активность энзима значительно повышается при разнообразных формах хирургической патологии, сопровождающихся шоковым состоянием, выра­женной гипоксией, декомпенсацией сердечно-сосудистой деятельности.

По данным Натальсона, у больных инфарктом миокарда активность фер­мента в сыворотке крови повышалась через 8—10 ч после начала приступа, до­стигая максимума через 24-28 ч, оставалась увеличенной на протяжении пер­вой недели заболевания, нормализуясь к 8—9-м сут. Характерно, что общая ак­тивность сывороточной ЛДГ у больных инфарктом миокарда сохранялась по­вышенной вдвое дольше, чем активность других ферментов.

Увеличение уровня мочевиностабильной фракции наблюдается еще в предынфарктном состоянии.

Следует отметить, что увеличение общей активности ЛДГ или отношения ЛДГ1/ЛДГз наблюдается не только при остром инфаркте миокарда. Но также гемолизе любого происхождения (in vivo и in vitro), анемии (гемолитической, пернициозной, серповидноклеточной, мегалобластной), остромнекрозе Почек.

Тромбоз легочной артерии характеризуется преимущественным увеличе­нием активности ЛДГз и менее значительным — ЛДГ4.

У больных со злокачественными новообразованиями доминирующей изо-формой энзима является ЛДГз.

При отеке поджелудочной железы у больных калькулезным холециститом увеличивается содержание ЛДГ5.

При желчнокаменной болезни без обтурации желчных ходов повышения активности ЛДГ не отмечено, тогда как у больных обтурационной желтухой на почве новообразования, билиарным циррозом, с опухолями поджелудочной железы она резко увеличена. То же наблюдается при желчном перитоните, когда в патологический процесс вовлекается печень.

К увеличению общей активности ЛДГ приводит прием алкоголя, кофеи­на, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих пре­паратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона.

Снижение активности лактатдегидрогеназы. В последнее время описано много случаев низкой активности ЛДГ в сыворотке крови. Существует две группы причин, обусловливающих снижение активности фермента в крови ^и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая — с генетическими нарушениями. Уменьшение активности ЛДГ вызывают оксалаты (используемые в качестве антикоагулянтов) и мочевина.

Работа №33 Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови

Креатинкиназа, именуемая также креатинфосфокиназой (АТФ: креатин-сфотрансфераза КФК, КК; КФ 2.7.3.2) представляет собой энзим, обратимо катализирующий фосфорилирование креатина при помощи аденозинтрифосфата:

КК

Креатин + АТФ ——>_ АДФ + креатинфосфат.

Актив­ность энзима повышается под влиянием тироксина, ионов магния, марганца, кальция и снижается под действием ионов цинка, меди, ртути.

Креатинкиназа (молекулярная масса 81 000 Д) играет важную роль в энергетическом обмене мышечной, нервной и других тканей. Наиболее богаты ею скелетная мускулатура, миокард и мозг. Достаточно высокая ак­тивность фермента выявляется в щитовидной железе и легких. В остальных органах, в том числе в печени, а также в эритроцитах обнаруживаются лишь «следы» активности КК.

Кретинкиназа (КК) - гетерогенный энзим, молекула которого состоит из двух субъединиц — В и М, обладающих примерно одинаковой молекулярной массой, соответственно 44,5 и 43 кД.

Поскольку молекула фермента имеет димерную структуру, при комбина­ции этих субъединиц образуется три изофермента: ММ — мышечный, ВВ — мозговой и MB — гибридный, содержащийся р большом количестве в сердечной мышце. В миокарде содержится два изо­фермента — MB и ММ, причем активность изофермента MB составляет около 25% от общей энзиматической активности.

Для определения активности КК применяют две основные группы мето­дов: по конечной точке и кинетические.

К числу первых прежде всего относят методы, основанные на оценке ла­бильности (неустойчивости) в кислой среде образуемого под влиянием КК креатинфосфата (в сравнении с ним АДФ и АТФ кислотоустойчивы). В спо­собе определения креатинкиназной активности по Еннору и Стоккену (1953) количество потребляемого в ходе реакции креатина устанавливается по цветной реакции его с альфа-нафтолом и диацеталом.

Активность креатинкиназы предпочтительно определять в сыворотке кро­ви. Сыворотку рекомендуется хранить в темноте при 4°С, так как фермент нео­братимо ингибируется под действием дневного (синего) света, особенно если образцы сыворотки заморожены.

Клетки крови должны быть отделены от плазмы (сыворотки) в течение 2 ч после пункции вены.

КК в сыворотке крови очень быстро инактивируется (!).

Физические нагрузки способны повысить каталитическую концентрацию КК в плазме крови.

Принцип. Креатинкиназа (КК) катализирует превращение креатина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорнованадиевомолибденовой кислоты.

Реактивы:

1) Стандартный раствор фосфора 1,20 ммоль/л (5 мл);

2) Аммоний ванадиевокислый, раствор 2 ммоль/л в хлорной кислоте 0,5 моль/л (55мл);

3) Аммоний молибденовокислый, раствор 30 ммоль/л (55 мл);

4) Кислота трихлоруксусная, раствор 0,15 моль/л (35 мл);

5) Буфер: глицин 2,5 ммоль, натрий углекислый 2 ммоль, магний сернокислый 0,17 ммоль/1 доза;

6) Субстрат: глицин 2,5 ммоль, натрий углекислый 2 ммоль, магний сернокислый 0,17 ммоль, креатин 1,9 ммоль/1 доза;

7) АТФ 0,07 ммоль двунатриевой соли аденозинтрифосфата (5 доз);

8) Активатор 0,25 ммоль цистеин хлорида /1 доза.

Приготовление рабочих растворов

Раствор 1. Содержимое пробирки с реактивом 6 растворяют в 10 мл бидист. воды при 80° С, по охлаждении до 20° С добавляют 15 мл бидист. воды и перемешивают.

Устойчивость: 2 недели при (+2 - +8)° С.

Раствор 2. Приготавливают растворением содержимого пробирки с реактивом 5 таким образом, как раствор 1.

Устойчивость: 2 недели при (+2 -+8)° С.

Раствор 3. Содержимое пробирки с реактивом 8 растворяют в 5 мл бидист. воды.

Устойчивость: 2 дня при (+2 - +8)° С.

Раствор 4. Содержимое пробирки с реактивом 7 растворяют в 2,1 мл бидист. воды.

Устойчивость: ежедневно приготавливают свежий раствор.

Раствор 5. Приготавливают смешиванием одинаковых долей реактива 2 и реактива 3.

Устойчивость: ежедневно приготавливают свежий раствор.

Проведение анализа. Длина волны (390-410) нм, кювета 1 см, температура инкубации (37±0,1)° С.

Отмерить, мл	Проба	Контроль 1	Стандарт	Контроль 2
Раствор 1	0,50	-	0,50	-
Раствор 2	-	0,50	-	0,50
Реактив 1	-	-	0,05	-
Раствор З	0,20	-	-	-
Сыворотка крови	0,05	0,05	-	-
Бидист. вода		0,20	0,20	0,25

Перемешивают и предварительно инкубируют 5 мин. При 37°С. Потом отмеривают:

Отмерить, мл	Проба	Контроль 1	Стандарт	Контроль 2
Раствор 4	0,10	0,10	0,10	0,10
Перемешивают и инкубируют точно 60 мин. При 37°С.
Реактив 4	0,30	0,30	0,30	0,30
Перемешивают и центрифугируют 5 мин. при 3000 об/мин.
Надосадочная жидкость	0,60	0,60	0,60	0,60
Раствор 5	0,60	0,60	0,60	0,60

Перемешивают и через 5 мин. измеряют оптическую плотность пробы (А1), контрольного раствора 1 (А2) стандарта (А3) и контрольного раствора 2 (А4) против воды.

Расчет.

(А1-А2)

Креатинкиназа (мккат/л) = 0,33 х ————

(А3-А4)

Нормы: - до 0,33 мккат/л.

Клиника-диагностическое значение определения активности креатинкиназы.

Поскольку изоферменты креатинкиназы находятся в скелетной мускулатуре, миокарде и центральной нервной системе, определение общей активности креатинкиназы требуется в основном для диагностики миопатий, инфаркта миокарда, заболеваний центральной нервной системы.

Данный тест получил наиболее широкое применение для диагностики ин­фаркта миокарда. Поскольку у больных с острой коронарной недостаточноетью скелетная мускулатура и ЦНС, как правило, не вовлекаются в патологиче­ский процесс, повышение активности КК в этих случаях обычно свидетельст­вует о поражении миокарда. При неосложненной стенокардии активность КК остается нормальной. При мелкоочаговом инфаркте миокарда чувствитель-,1 ность теста составляет 92%. Возрастание активности фермента начинается уже через 2-3 ч от начала приступа, повлекшего острое нарушение коронарного кровообращения. Максимум ее, в 5-10 раз превышающий норму, наблюдает­ся через 13—30 ч. Нормализуется активность КК на 2-е—3-й сут. При крупно­очаговом инфаркте миокарда чувствительность теста соответствует 98%. Ак­тивность фермента, в 15—20 раз превышающая норму, приходит к исходной величине на 5—8-е сут от начала заболевания.

Определение общей активности КК в сыворотке в динамике острого и подострого периодов течения инфаркта миокарда может иметь известное про­гностическое значение.

Наилучший тест для диагностики инфаркта миокарда - исследование

МВ-изофермента. Его максимальная активность отмечается через 20 ч после появления первых клинических симптомов инфаркта миокарда, снижение до нормального уровня обычно происходит спустя 40-50 ч от начала заболева­ния.

В остром периоде инфаркта миокарда соотншение МВ-КК/ общая КК увеличивается от 3 до 40%, КК/АсТ — от 2 до 9,6%, КК/ЛДГ - от 0,27 до 1,6% (Макаровский В.В., 1989).

Высокую активность КК (в 6—10 раз превышающую верхний предел нор­мы) находят у больных с мышечной дистрофией.

Высокая активность КК выявляется и при других мышечных заболеваниях — миокардите, воспалительных и дистрофических поражениях скелетной муску­латуры (полимиозит, дерматомиозит, мышечная дистрофия Дюшенна и др.), столбняке, генерализованных судорогах, пароксизмальной тахикардии, кате­теризации сердца, внутримышечных инъекциях лекарственных средств (осо­бенно наркотических и анальгезирующих препаратов), гипертермии.

Повышенные значения активности фермента выявляются и у практически здоровых людей после энергичных физических упражнений, при тяжелой фи­зической работе, спортивных нагрузках, проведении хирургических вмеша­тельств.

Активность энзима значительно возрастает у больных с острым течением ревматизма (ревмокардита). При ревматоидном артрите отмечено 5—6-кратное увеличение активности КК в сыворотке крови, не зависящее от степени активности воспалительного процесса в целом.

Наибо­лее высокая активность фермента отмечалась при поражении большого коли­чества суставов и патологических изменениях в состоянии скелетных мышц.

Активность фермента возрастает при алкогольной интоксикации (приеме алкоголя может вызвать «острый мышечный синдром»), уменьшении кровоснабжения мышц, застойной сердечной недостаточности, длительной гипотермии, эмболии легочной артерии, сахарном диабете, гипотиреозе, заболеваниях ЦНС.

Значительное уменьшение активности фермента наблюдается при дейст­вии на пробу сыворотки (плазмы) крови прямых солнечных или ультрафиоле­товых лучей.