Глава 2. микроскоп и микроскопические методы исследования

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2мкм (бактерии, простейшие и т. п.), а электронные — для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы).

Различают простые и сложные световые микроскопы. Оптика простых микроскопов представлена одной линзой с большим увеличением. В сложных микроскопах оптиче­ская система состоит из объектива для получения увели­ченного изображения объекта и окуляра для дальнейшего увеличения полученного изображения и его рассматривания.

Современные световые микроскопы, позволяющие не только увидеть микроорганизмы, но и изучить их структу­ру,— это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и боль­шой аккуратности.

Биологические световые микроскопы, в зависимости от области применения, сложности устройства и комплек­тации различной оптикой, подразделяются на рабочие, лабораторные и исследовательские. В микроскопе различают механическую и оптическую части.

Рис.2 Микроскоп

К механической части относится штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером длякрепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макро­винт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая, в свою очередь, состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя с низковольтной лампой накаливания и тран­сформатором. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают из­ображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса.

Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра и дающий возможность наблюдения двумя глазами) тубусы.Кроме того, тубусмикроскоп может быть прямой верти­кальный (в основном для фотографирования) и наклон­ный.

Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изобра­жение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.

Четкость определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения — минимальное рассто­яние, на котором эти точки еще видны раздельно, - зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая аперту­ра в свою очередь зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура — это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500—1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90 — 100х).

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, име­ющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.

В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Недо­статком кедрового масла является его быстрое загустевание. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Изображение, полученное с по­мощью линз, обладает различными недостатками: сфери­ческой и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из несколь­ких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использова­ние этих объективов позволяет получить резкое изобра­жение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характери­стики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО — апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии — обозначение МИ и черное кольцо.

Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17 мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40х). При работе с иммерси­онными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм. потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.

Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нес­кольких типов, каждый из которых применяется с опреде­ленным типом объектива, дополнительно устраняя недо­статки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.

Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусиро­вать на препарате свет от осветителя. Он состоит из нескольких линз, превращающих параллельные лучи от осветителя в сходящиеся. Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значение для правильного освещения препарата. Освети­тель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, накал которой можно регулировать, кол­лекторной линзы и полевой диафрагмы (от раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате). Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала. Качество изображения в значи­тельной мере зависит также от правильного освещения.