Иммунологические методы
ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
КАФЕДРА «МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ»
Н. Н. Митрофанова
В.Л. Мельников
ИММУНОЛОГИЯ
Учебно-методическое пособие
для студентов медицинских вузов
ПЕНЗА 2013
Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов «Иммунология» составлено в соответствии с программой для студентов 2 курса специальности «Лечебное дело» по иммунологии 2010 г.
По каждой теме сформулирована цель занятия. Имеется план и методика выполнения различных экспериментальных работ. Приведены современные методы диагностики различных инфекций.
Руководство рекомендовано для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям.
Рецензенты:
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей»
Б.А. Молотилов;
кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой инфекционных болезней УО «Гомельский государственный медицинский университет»
Е.Л. Красавцев
Тема 1: ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ОСНОВНЫЕ МОДЕЛИ В ИММУНОЛОГИИ. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ.
Цель: Познакомиться с предметом и задачами иммунологии, с историей развития и основными теориями иммунитета. Выучить и научиться выполнять правила противоэпидемического режима и техники безопасности в иммунологической лаборатории. Изучить объекты исследования в иммунологии.
Вопросы для самостоятельной подготовки:
1. Предмет и задачи иммунологии
2. История развития иммунологии.
3. Инструктивные и конструктивные теории иммунитета.
4. Клонально-селекционная теория Бернета
5. Оснащение и режим работы иммунологической лаборатории
6. Основные подходы к стандартизации лабораторного иммунологического обследования
7. Объекты исследования в иммунологии
8. Инбредные животные.
9. Биологические материалы для исследований.
10. Особенности работы с иммунокомпетентными клетками.
11. Иммунологические методы, применяемые в эксперементальных и клинических исследованиях.
План
Программа:
1. Предмет и задачи иммунологии, история развития.
2. Теории иммунитета
3. Правила по технике безопасности.
4. Основное оборудование иммунологической лаборатории.
5. Объекты исследования в иммунологии
Демонстрация:
1. Оборудование лаборатории.
2. Приемы работы с бактериологической петлей, спиртовкой, чашкой Петри, бактериологической пробиркой.
3. Фламбирование бактериологической петли
Задание студентам:
1.Освоить работы с бактериологической петлей.
2. Освоить правила работы с чашкой Петри, бактериологической пробиркой, спиртовкой, шпателем.
3. Научиться фламбировать бактериологическую петлю.
4. Научиться забирать ПБА с поверхности питательной среды.
5. Заполнить таблицу: Теории иммунитета
Информационный материал
Все иммунологические исследования проводят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования и от целевой направленности.
Объекты исследования:
1. Бактерии
2. Вирусы
3. Грибы
4. Простейшие
5. Человек
Целевая направленность:
1. Научные исследования
2. Диагностика заболеваний.
Изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных осуществляют в иммунологических и серологических лабораториях.
Иммунологические лаборатории могут входить в состав:
1. Центров Роспотребнадзора
2. Диагностических центров
3. Лабораторий крупных больниц
4. НИИ
В центрах Роспотребнадзора проводят серологические анализы материалов, полученных от больных и контактных лиц, обследуют бактерионосителей, проводят санитарно-микробиологические исследования объектов внешней среды.
В серологических лабораториях больниц и диагностических центров проводят исследования с целью диагностики инфекционных заболеваний.
В иммунологических лабораториях НИИ проводят научные исследования.
Иммунологические лаборатории размещаются в нескольких помещениях. В лаборатории предусмотрены:
1. Помещение для иммунологических исследований
2. Помещение для серологических исследований
3. Помещение для мойки и стерилизации посуды
4. Виварий с боксами
5. Регистратура
Оборудование: перечислить, указать назначение.
Иммунологические методы
1. Методы определения веществ, характеризующихся наличием АТ против них
Методы иммуноанализа
а) РА
б) Методы гемолиза
в) РП
г) ИФА, РИА, иммунофлюоресцентный анализ
2. Методы фракционирования
а) Выделение Ig солями серной кислоты
б) Методы хроматографии
в) Центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности
г) Электрофорез
д) Проточная цитофлюометрия
3.Иммуногистохимические методы
4. Методы молекулярной биологии (ПЦР)
1. Генетические методы
а) Методы направленного мутагенеза
б) Методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования мутаций
5. Методы биотехнологии – клонирование молекул, ПЦР, получение рекомбинантных белков, создание инбридных генов
6. Методы изучения свойств нативных клеток иммунной системы в культурах in vitro
7. Методы исследования функции и взаимодействия клеток in vivo
По определению экспертов ВОЗ Клиническая иммунология – это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические состояния (механизмы) и состояния, в терапии и профилактике которых иммунопрепараты играют ведущую роль.
Клиническая иммунология и иммунологическая служба должны состоять из клинической и лабораторной составляющих.
Лабораторная иммунологическая диагностика – одно из направлений клинической лабораторной диагностики должна развиваться в соответствии с нормативной базой, принятой для подразделений лабораторной службы.
В РФ создана сеть лабораторной клинической иммунологии, разработана методология оценки иммунного статуса населения. В соответствии с решением Комиссии МЗ СССР (№16-1 от 22.08.1990 г.) «О развитии клинической иммунологии» в стране в некоторых городах (Москва, Владивосток, Омск, Тюмень, Екатеринбург) созданы региональные центры клинической иммунологии.
Для того, чтобы иммунологическая диагностика могла эффективно использоваться клиницистами, необходимо сформулировать основные принципы организации иммунологической лаборатории.
1. Востребованность клиницистами
2. Минимум «ненужных» анализов,
3. Преемственность лабораторных иммунологических исследований
4. Стандартные протоколы методов
5. Контроль качества
6. Рентабельность лаборатории.
Первый официальный документ, регламентирующий деятельность иммунологической лаборатории – Приказ МЗ СССР (№539 от 18.04.1986 г.) «Об организации лабораторий клинической иммунологии» обязывал определять 6 показателей периферической крови:
1. Количество Т-лимфоцитов
2. Количество В-лимфоцитов
3. Количество фагоцитирующих нейтрофилов
4. Иммуноглобулины А, М, G сыворотки крови
Успехи фундаментальной иммунологии, основанные на достижениях молекулярной биологии и генной инженерии, обусловили новый этап в развитии иммунологических лабораторий. В конце прошлого века стало очевидно, что большинство областей клинической медицины нуждаются в помощи иммунологических лабораторий. Инфекционисты, кардиологи, дерматологи, эндокринологи, ревматологи и другие врачи нуждаются в обнаружении и количественном определении специфических антител или аутоантител в сыворотке крови, на мембранах циркулирующих клеток и в тканях.
С заболеваниями, в патогенезе которых ведущую роль играют аллергические реакции, сталкиваются представители других клинических специальностей.
Таблица 1.Участие аллергических реакций разных типов в патогенезе патологических состояний, встречающихся в различных клинических дисциплинах
| Тип аллергической реакции | Диагноз | Клиническая дисциплина |
| I | Анафилаксия | Внутренние болезни Реаниматология |
| I, II, III, IV | Лекарственная аллергия | Анестезиология Внутренние болезни Кожные болезни Стоматология |
| I – III | Ангионевротический отёк | Внутренние болезни |
| I – IV | Бронхиальная астма Хроническое обструктивное заболевание лёгких Бронхит | Пульмонология |
| I – IV | Атопический дерматит Экзема Контактный дерматит | Кожные болезни |
| I – IV | Пищевая аллергия | Гастроэнтерология |
| I – IV | Острый отит Хронический отит Ринит, синусит | ЛОР |
| IV – I | Конъюнктивит | Глазные болезни |
Врачи разных специальностей ставят перед иммунологической лабораторией задачу выявления иммунодефицитных состояний. Диагноз «иммунодефицит» является лабораторным диагнозом.
При многих заболеваниях иммунологическая лаборатория необходима при оценке прогноза заболевания, стойкости ремиссии, вероятности рецидива, полноты выздоровления, при назначении иммунокорректирующей терапии.
Современная иммунологическая лаборатория имеет возможность провести:
1. Оценку иммунного статуса
2. Диагностику первичных иммунодефицитов
3. Аллергодиагностику
4. Диагностику аутоиммунных, инфекционных, онкологических заболеваний
5. Обеспечить трансплантацию.
Необходимо построение системы медицинских стандартов иммунологического обследования больного. Составляющие стандартизации иммунологического обследования:
1. Стандартизация показаний к лабораторному иммунологическому обследованию
2. Стандартизация определения лабораторных иммунологических показателей
3. Стандартизация интерпретации результатов.
1. Стандартизация показаний к лабораторному иммунологическому обследованию включает:
Цель и задачи обследования
Диагностика
Мониторинг
Назначение иммунокорректирующей терапии
Выбор показателя с позиций доказательной медицины
Определение объема иммунологического обследования.
2. Стандартизация определения лабораторных иммунологических показателей включает:
А) Стандартизация доаналитического этапа
Подготовка больного
Взятие биологического материала
Режим хранения и доставки материала в лабораторию
Регистрация и маркировка образцов
Первичная обработка биоматериала
Банкирование биоматериала
Б) Стандартизация аналитического этапа
Протоколы методов
Стандарты внутреннего контроля качества
Программы внешнего контроля качества
В) Стандартизация постаналитического этапа
Форма представления окончательного результата
Унификация значения нормы
3. Стандартизация интерпретации результатов включает:
Сопоставление результатов с клиническими данными
Сравнение диагностической информативности отдельных показателей
Алгоритмы диагностики
Заключение
Подтверждение диагноза
Определение фазы заболевания
Описание иммунной системы
Рекомендации
Проведение дополнительного обследования
Назначение иммунокорректирующей терапии
Специализированные программы внешней оценки качества
Объекты исследования
Для проведения фундаментальных исследований в иммунологии лучший объект – инбредные мыши.
Инбредные животные – животные, полученные путём инбридинга, т.е. последовательных близкородственных скрещиваний с целью получения гомозиготного и генетически идентичного потомства.
Среди потомков для дальнейших скрещиваний сначала отбирают особей по признакам внешнего сходства, в последних поколениях тестируют на совпадение групп крови и приживления кожных лоскутов. Через 20 поколений и более получают мышей с высокой степенью гомозиготности, обозначенных как чистая линия.
Главная цель выделения чистых линий – получение возможности много кратного повторения экспериментов на генетически одинаковых организмах, т.е. обеспечение воспроизводимости результатов исследования. Мыши стали основными экспериментальными животными в иммунологии, так как:
1. Имеют короткий срок беременности (21 сут), множественное потомство, что позволяет быстро вывести чистые линии
2. Себестоимость содержания
3. Структура и функции иммунной системы мыши и человека сходны
4. Выведение чистых линий мышей показало, что некоторые из них жизнеспособны, несмотря на гомозиготность, т.е. не всегда инбридинг приводит к вырождению.
Созданы линии мышей с заданными характеристиками, что позволяет выбирать особей для достижения конкретных целей. Характеристики животных разных линий документированы. Наиболее известные питомники: Джексоновская лаборатория в США ежегодно поставляет 2 млн. животных 2500 различных линий. 97% этих животных можно приобрести только у них. В каждом питомнике линии мышей имеют паспорт – систематизированы в базах данных. Известен гаплотип (Н-2) мышей разных линий, окрас, поведенческие реакции, особенности функционирования иммунной системы и др.
Кроме чистых линий выводят конгенных мышей. Это линии, отличающиеся небольшой частью генома. В основе выведения конгенных мышей лежит возвратное скрещивание – получение потомства в ряду поколений от скрещивания гетерозиготы (потомков гомозиготных родителей, генетически отличающихся между собой) с одним из исходных гомозиготных родителей. Это скрещивание проводится для внедрения комплекса Н2 донорской линии А в генотип основной линии В.
Например, при скрещивании маркирующей линии А и основной линии В получают гибриды первого поколения F1 (а/b, генерация I). При дальнейшем скрещивании гибридов F1 с особями основной линии В, получают потомство, состоящее из гомозигот (b/b) и гетерозигот (а/b) по комплексу Н2. В последующих скрещиваниях отбираются только гетерозиготные особи, имеющие признак А (Н2а), которые определяются по приживлению кожного трансплантанта от маркирующей линии А и положительной серологической реакции клеток крови с анти-А-сывороткой. По мере продолжения скрещиваний α-положительных особей с особями основной линии В доля генома линии А постоянно снижается, но при этом для дальнейшего размножения из потомства отбирают только тех особей, которые сохраняют признак А (Н2а). К 12 поколению (генерация №12) практически весь геном отбираемых после гибридизации мышей представлен основной линией В, за исключением признака А, по которому шёл отбор.
Дальнейшая задача состоит в переводе признака в гомозиготное состояние. Для этой цели гетерозигот (а/b) скрещивают между собой и отбирают для дальнейшего размножения только тех особей из потомства, которые отторгают кожный трансплантат, взятый от особи линии В и не дают реакции с анти-В-сывороткой. Этот отбор выявляет особей с присутствием признака В (Н2b) и гомозиготность по признаку А (Н2а). Таким образом, в результате применения данной схемы скрещивания, в геном основной линии В внедряется комплекс Н2 маркирующей линии А. С момента перевода комплекса Н2а в гомозиготное состояние констатируется получение новой конгентной (по отношению к основной) линии В.