Правила приготовления препаратов (мазков) из биологического материала для цитологического исследования

Знать:

- основы получения материала для цитологического исследования;

- характеристику основных способов получения биоматериала для цитологического исследования;

- методику приготовления стекол для получения мазков.

Уметь:

- оценить правильность получения материала для цитологических исследований.

Материалом для цитологической диагностики может быть:

• пунктат молочной железы;

• отпечатки с биоптата;

• соскоб с ткани молочной железы (или опухоли), удаленной во время операции;

• выделения из соска (метод практически неэффективен для диагностики злокачественных новообразований молочной железы, за исключением внутрипротокового рака);

• материал, полученный с эрозивных поверхностей.

Для диагностического заключения по цитологическим препаратам важно получение полноценного материала: он должен быть взят не из окружающих тканей, а из очага поражения. Трудности могут отмечаться при выраженном фиброзе или наличии кистозно измененных участков, в таких случаях нужно пытаться получить материал из разных участков опухоли, из стенок кисты; при некротических изменениях - стараться брать материал из периферии опухоли.

Клеточный материал наносят сухим инструментом тонким слоем в продольном направлении (или готовят отпечатки с ткани) на чисто вымытые, обезжиренные 96% спиртом и натертые досуха предметные стекла или помещают в среду накопления ("жидкостная" цитология).

Емкости для доставки материала: пробирки, чашки Петри и т.д. должны быть чистыми, после обработки в сухожаровом шкафу. Подсушивание цитологических мазков проводят при комнатной температуре на воздухе.

Если методика окрашивания (Папаниколау и др.) требует влажной фиксации мазка, то сразу после получения материала мазок обрабатывают аэрозолем для фиксации или капельным фиксатором или помешают на 10 минут в 96 % спирт, после чего препарат высушивают на воздухе.

Цитологические препараты с тканевого кусочка готовят до его обработки формалином. Направляемый на цитологическое исследование материал нельзя делить ни части и рассылать в разные лаборатории, т.к. характерные изменения могут быть в одной части материала и не быть в другой.

Цитологический метод технически прост, быстр, сравнительно дешев, малотравматичен. Однако «легкость» цитологического метода обманчива, так как цитологическое исследование должно заканчиваться формулировкой заключения, основываясь на котором разрабатывается тактика лечения.

По способу получения материала цитологию можно подразделить на дооперационную (эксфолиативную, абразивную, аспирационную) и интраоперационную.

1. Эксфолиативная цитология включает в себя исследование вагинальных мазков, мокроты, мочи, плевральной, перитонеальной, перикардиальной, цереброспинальной, синовиальной жидкости и т.д. Этот раздел цитологии отличается простотой техники получения большого количества различного типа клеток, в том числе воспалительного ряда. Клеточный материал может быть не очень хорошо сохранен. Для получения информативного материала с поверхности патологического очага удаляют гноевидные массы, корочки, некротический налет. Если полученный материал представляет жидкость, то в нее добавляется цитрат натрия, чтобы жидкость не свернулась.

Абразивная цитология получает материал из определенного участка внутренних органов, в том числе исследуются субэпителиальные поражения с помощью фиброоптических инструментов. При таком взятии материала клетки хорошо сохраняются, и препараты легко интерпретировать. Материал получают из шейки матки, вагины, эндометрия, респираторного, желудочно-кишечного, мочеполового тракта.

2. Наибольшее значение имеет интраоперационное цитологическое исследование, применяемое для диагностики и определения тактики лечения опухоли в процессе оперативного вмешательства. Результат интраоперационного цитологического исследования может быть получен в более короткие сроки, чем гистологический анализ криостатных срезов, при этом точность обоих методов сопоставима.

Получение эксфолиативного материала. Мазки из отделяемого для цитологического исследования готовятся из клеточных элементов, которые легко слущиваются с поверхности слизистых и серозных оболочек и/или спонтанно попадают в различные выделения (выпоты, секреты, мокроту, патологические выделения из молочной железы, плевральный эксудат, мочу). Для приготовления препарата капля отделяемого (из молочной железы, свищей и др.) наносится на стекло и готовится мазок.

Мазки - отпечатки: к месту поражения прикладывается предметное стекло, на котором остается некоторое количество клеточных элементов и слизистого отделяемого:

- с места выделения (сосок молочной железы, выходное отверстие свища);

со слизистой оболочки, изъязвленной поверхности слизистых и кожных покровов;

- материал с пораженного участка можно брать также с помощью ватного тампона и наносить на предметное стекло в виде отпечатков.

Мазки-отпечатки из соскоба готовятся с помощью шпателя, края предметного стекла, скальпеля: соскобы делаются осторожно с легкодоступных очагов поражения, обилие слизи и некротических масс в биологическом материале препятствуют правильному приготовлению мазка, поэтому гнойные корки и некротические массы должны быть удалены. В настоящее время появились новые технологии приготовления цитологических препаратов ("жидкостная" цитология), обеспечивающие высокую степень концентрации клеток ("Cellprint", Cytospin и т.д.). Использование "жидкостной" цитологии особенно рекомендуется при выполнении иммуноцитохимических исследований. Цитологические препараты из осадка доставленной в лаборатории жидкости серозных полостей и содержимого кист получают путем пункции плевральной, перикардиальной, брюшной полости и кист: в жидкость добавляют консервант, чтобы предотвратить свертывание (1 г лимоннокислого натрия на 1 л жидкости), тщательно перемешивают стеклянной палочкой. В лабораторию доставляют всю полученную жидкость для исследования, если количество жидкости слишком велико (несколько литров), то жидкость отстаивают (около часа), сливают верхний слой, а отстоявшийся нижний (в пределах 1 л) доставляют в лабораторию.

Что такое жидкостная цитология?

Основная идея этой технологии заключается в том, что клеточный материал, полученный с поверхности шейки матки и из цервикального канала посредством щеточки, не переносится сразу на стекло, а вместе со съемной щеточкой погружается в специальный флакон с особым раствором.

Этот раствор «консервирует» собранный врачом клеточный материал, препятствует повреждению клеток, позволяет преодолеть бактериальное «засорение» и дает возможность в оптимальных условиях транспортировать собранные клетки в лабораторию. И для врача, и для его пациенток преимуществами при использовании жидкости являются ее устойчивость к колебаниям температуры, возможность хранения клеточного материала в течение нескольких лет и возможность проведения любых ПЦР-исследований, в том числе и на вирус папилломы человека.

Все исследования можно проводить из одного флакона с жидкостным цитологическим материалом; от пациентки не требуются дополнительные визиты к врачу, а это значит, что осуществление одновременного или последовательного проведения цитологии и генетической детекции вируса, а, следовательно, полноценного скрининга поражений шейки матки в данном случае максимально облегчено.

Использование жидкостного способа сбора материала для обследования женщин на инфекционную патологию шейки матки является наиболее логичным и экономически обоснованным подходом. Но самое главное заключается в том, что эта новая технология позволяет усилить эффективность цервикального скрининга и не «пропустить» тех женщин, у которых поражения на шейке уже приобрели статус «предрака».

Только при одновременном отсутствии патологии и в цитологическом мазке, и при ПЦР-тестировании вероятность пропустить поражения шейки матки высокой степени тяжести практически отсутствует и минимальна для более легких поражений.

Получение пункционного материала. Пункцию проводит врач, как правило, под контролем ультразвукового исследования, реже под контролем рентгеновского исследования. Для получения полноценного материала для цитологического исследования при проведении диагностической пункции необходимо соблюдать ряд правил:

- пункцию проводят с соблюдением правил асептики и антисептики.

- нельзя пунктировать опухоль при подозрении на меланому;

- перед проведением пункции опухоль тщательно пальпируют, определяют ее подвижность, связь с окружающими тканями и возможность оптимальной фиксации;

- игла и шприц для пункции должны быть абсолютно сухими;

- не следует проводить обследуемому анестезию пунктируемого образования (сама пункция не более болезненна, чем прокол иглой для анестезии, кроме того, применение новокаина может вызвать изменение клеточных элементов);

- мандреном, как правило, не пользуются, так как используемые для диагностических пункций иглы имеют очень маленький диаметр и косой срез на конце, игла легко продвигается через ткани, расположенные над опухолью (кожу, подкожную клетчатку, мышцы), расслаивая их, закупорка иглы происходит очень редко. Однако при пункции богато васкуляризированных образований (щитовидная железа, сосудистые опухоли, кости и др.) необходимо использовать иглу с мандреном, последний извлекается после введения иглы в исследуемое образование;

- пункцию различных образований, в том числе опухолей производят тонкой иглой (наружный диаметр 0,6-0,7 мм), которая присоединяется к шприцу 20 мл.

Методика проведения пункции тонкой иглой. Опухоль фиксируют пальцами левой руки. Иглу без шприца (или с присоединенным шприцем с опущенным поршнем) вводят перпендикулярно через кожу в исследуемое образование. По достижении очага поражения осторожно пальпируют ткань вокруг введенной иглы, определяя правильность прокола; при небольшом подкожном узле можно несколько наклонить иглу, при этом опухоль на игле сместится, что ощущается пальцами и подтверждает правильное положение иглы. Не рекомендуется производить вращательные движения иглой, так как это наносит лишнюю травму и не приводит к получению более полноценного материала. После этого присоединяют шприц с опущенным поршнем (если он не был присоединен сразу) и делают 2-3 резких насасывающих движения, снимая шприц с иглы после каждого подъема поршня. По окончании взятия шприц необходимо снять, иглу извлекают без шприца, что позволяет сохранить материал; для цитологического исследования достаточно материала попавшего в просвет иглы. Содержимое иглы выдувается на предметное стекло при помощи шприца, который наполняется воздухом и вновь соединяется с иглой. Содержимое размазывается по стеклу другим стеклом или ребром иглы. Если при проколе опухоли появляется жидкость, то под иглу подставляют пробирку и собирают жидкость. Если жидкость не стекает, можно использовать шприц, осторожно оттягивая поршень и, набирая жидкость в шприц, после чего шприц снимают и жидкость сливают в пробирку. После удаления жидкости иглу вводят в более плотную ткань пунктируемого образования и получают пунктат в просвете иглы.

Получение биопсийного и операционного материала. Цитологические препараты (отпечатки и соскобы) можно делать из материала, полученного при биопсии или хирургической операции:

- отпечатки выполняются путем прикладывания стекла к биопсированному кусочку или разрезу удаленной опухоли;

- разрез опухоли или лимфатического узла необходимо проводить сухим скальпелем, чтобы избежать разрушения клеток водой;

- если консистенция ткани плотная (костная, хрящевая) и не позволяет сделать отпечатки, производят соскоб с поверхности свежего разреза опухоли (путем легкого соскабливания предметным стеклом или скальпелем). При проведении эндоскопического обследования материал для цитологического исследования берут с помощью специальных приспособлений: аспираты промывных вод - с помощью отсасывающего устройства, при бронхоскопии - для приготовления мазков из бронхоальвеолярных лаважей используется технология цитоцентрифугирования (Cytospin); мазки-отпечатки из материала щипковых биопсий, браш-биоптаты, пунктаты и др.).

Правила доставки биологического материала в лабораторию.

1. Флаконы с материалом и стекла-мазки должны иметь идентификацию (маркировку): на них должна быть четко нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для цитологического исследования. Для приготовления цитологических препаратов предпочтительнее использовать предметные стекла со шлифованным краем. которые легко маркируются.

2. Цитологический материал доставляют в лабораторию в ближайшие сроки после его взятия. Особенно это относится к жидкостям, мокроте, содержимому кист и любому кровянистому материалу.

3. Для доставки необходимо иметь специализированные контейнеры для предметных стекол, пробирки, чашки Петри, емкости разного объема. Не допускается контакт нативного материала, в том числе подсушенного предметного стекла с бланком - направлением.

4. Полученный материал доставляют в лабораторию с бланком-направлением, в котором должны быть представлены паспортные данные обследуемого пациента, диагноз, проведенная терапия, точно должно быть указано место участка, откуда был взят материал, и способ его получения.

5. Сотрудник лаборатории, который принимает материал, должен проверить маркировку препаратов, пробирок и т.д., оформление направления, отметить характер и количество биоматериала, число присланных мазков

Правила приготовления препаратов (мазков) из биологического материала для цитологического исследования.

Методика приготовления мазка.

Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологических особенностей клеток в мазке является правильно сделанный, качественно фиксированный, хорошо окрашенный и методологически корректно изученный мазок, поступающий в лабораторию в сопровождении необходимых клинико-инструментальных и анамнестических данных. Невыполнение этих условий ведет к неправильному распределению клеток ткани, неполному выявлению их морфологических особенностей, "пропуску" важной диагностической информации на предметном стекле или отсутствию корригирующей клинической информации и, тем самым, к ошибочной оценке цитологической картины, а значит к неполноценному или ошибочному диагнозу. Если мазки были приготовлены вне лаборатории, то в соответствии с теми же требованиями оценивается их макроскопический вид. Сотрудники лаборатории должны постоянно обучать представителей клинических отделений, участвующих в приготовлении мазков.

Правильно приготовленный мазок из нормальной или патологически измененной ткани должен отвечать следующим условиям:

1. Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1.5 см от другого края предметного; мазок не должен достигать длинного края стекла, между мазком и краем предметного стекла должно оставаться расстояние примерно 0.3 см.

2. Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всем протяжении.

3. Мазок из осадка жидкого материала (жидкость из серозной полости, смыв из различных органов, содержимое кистозной полости и т.п.) должен заканчиваться у одного из узких краев предметного стекла в виде следа, оставленного как бы тонкой щеткой.

4. Клетки в мазке должны быть равномерно распределены, все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать "толстые участки", содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток.

Правила фиксации мазка.

Фиксация мазка проводится в соответствии с методикой, обусловленной биологическим материалом, взятым для цитологического исследования (влажная фиксация биологического материала или подсушивание его на воздухе). При влажной фиксации приготовленный мазок помещается в фиксирующую жидкость, затем подсушивается на воздухе. Недостаточная фиксация мазка ведет к некачественному окрашиванию клеток.

1. Правильная фиксация мазка обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся в красках воде, которая в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка происходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному стеклу;

2. При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы, прописи приготовления которых приводятся в соответствующих руководствах.

3. Рекомендуемые фиксаторы: - метиловый спирт; - этиловый спирт; - смесь Никифорова; - фиксатор Май-Грюнвальда; - фиксатор Лейшмана; - ацетон (для иммуноцитохимии). Лучшим фиксатором является метиловый спирт, на основе которого готовят фиксатор Лейшмана и Май-Грюнвальда.

Правила окрашивания мазка.

Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии. В адекватно окрашенном мазке структуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек окрашены селективно.

1. При применении любой методики окрашивания мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания.

2. Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, которые устанавливают при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (pH 6,8 -7,2), что обеспечивается использованием буферных растворов.

3. Рекомендуемые методы окрашивание цитологических мазков: - азур-эозиновый, (по Романовскому, Лейшману, Май-Грюнвальду, Панпенгейму и др.); - гематоксилиновый; - гематоксилин-эозиновый; - метод Папаниколау.

4. Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками.

Приготовление стекол

Стекла для приготовления цитологических препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.

1. Стекла тщательно промывают щеткой в теплой мыльной (или с моющим средством) воде.

2. Основательно промывают в проточной теплой воде.

3. Затем кипятят 1-2 часа в воде с добавлением соды (2-3%) или моющего средства.

4. После хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают в проточной (1-2 часа).

Обработанные и промытые в воде стекла протирают мягкой тряпкой, держа стекла за края, и хранят в смеси Никифорова (равные части 96° спирта и эфира). По мере надобности пинцетом извлекают стекла из смеси Никифорова и протирают сухой тряпкой. Обработанные таким образом стекла могут быть использованы для приготовления цитологических препаратов.

Для проведения цитохимических исследований очень хорошие результаты дает обработка предметных стекол и других стеклянных предметов в хромовой смеси следующего состава:

Двухромовокислый калий (бихромат калия) - 100 г; вода горячая - 1000 мл; неочищенная серная кислота - 100 мл.

Для приготовления хромовой смеси растворяют в горячей воде двухромовокислый калий, затем охлаждают раствор и после этого добавляют серную кислоту. Кислоту льют осторожно (обязательно в вытяжном шкафу), при этом смесь весьма сильно нагревается и приобретает темно-коричневый цвет. В этом составе предметные стекла и другую стеклянную посуду выдерживают 2-3 дня, а после промывают в проточной воде в течение 1-2 часов.

На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться тонким слоем, а не собираться в капли.

Для обеспечения надежной маркировки стекол используют механический и химический способы «матирования» края поверхности стекла. Механический способ основан на обработке предметного стекла абразивным камнем на станке. При использовании второго способа в пластмассовый сосуд вместимостью около 300 мл помещают 50 г фторида аммония и 50 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь тщательно перемешивают до кашицеобразной консистенции (в вытяжном шкафу). Высота слоя смеси в сосуде не должна превышать 1,5 см. Чистые предметные стекла устанавливают вдоль стенок сосуда таким образом, чтобы один конец стекла был погружен в смесь. В сосуде последовательно размещают 20 - 25 предметных стекол. Через 1 мин стекла переносят на 10-15 мин в пластмассовое ведро с большим количеством воды. Затем воду сливают и стекла обрабатывают слабым раствором серной кислоты (5 мл концентрированной кислоты на 8-10 л воды) для их обезжиривания. После этого стекла тщательно промывают водой и просушивают (можно с помощью вентилятора). Всю работу по подготовке предметных стёкол выполняют в резиновых перчатках. Смесь фторида аммония и концентрированной соляной кислоты можно использовать многократно, добавляя небольшое количество кислоты. Маркировать стекла можно также, подписывая один край стекла тушью.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ

1.Основные этапы цитологического исследования

2. Способы получения материала для цитологического исследования

3. Дооперационные и интраоперационные способы получения материала, характеристика

4. Получение эксфолиативного материала, характеристика

5. Жидкостная цитология

6. Получение пункционного материала

7. Методика проведения пункции тонкой иглой

8. Получение биопсийного и операционного материала

9. Правила приготовления стекол для цитологических исследований

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Записать протокол практического занятия с указанием цели и задачи, способов взятия и подготовки материала для цитологических исследований.