Тема ІІІ. Вещества, изолируемые из объектов минерализацией биоматериала.
Метод минерализации используется при исследовании биоматериала для определения «металлических ядов», поступающих в организм в виде солей, оксидов и других соединений, в основном, перорально и вызывающих отравления.
Важнейшие «металлические яды» - соединения бария, висмута, кадмия, марганца, меди, ртути, свинца, серебра, таллия, хрома, цинка и др. металлов, а также некоторые соединения некоторых неметаллов (мышьяк, сурьма и пр.). некоторые из перечисленных элементов, находясь в микроколичествах (микроэлементы), являются необходимыми для нормальной жизнедеятельности (кобальт, медь, марганец, цинк входят в состав кофакторов и ряда ферментов).
Токсичность «металлических ядов» объясняется связыванием их с соответствующими функциональными группами белков пептидов, аминокислот в организме, в результате чего нарушается нормальное функционирование клеток и тканей организма. Основные функциональные группы, взаимодействующие с ионами металлов: -СООН, -NH2, -SH, -OH, -C6H4OH, -S-S-, при этом образуются как ионные, так и ковалентые связи, зависящие от природы катиона. Для обнаружения «металлических ядов» необходимо разрушить их связи с органическими веществами и перевести их в ионное состояние. Для этой цели применяют методы «сухого» (нагревание органических веществ до 300-400 оС при доступе воздуха или сплавление с нитратами щелочных металлов) и «мокрого» (деструкция минеральными (азотная, серная, хлорная) кислотами, хлоратом калия и пергидролем) озоления.
Метод минерализации основан на окислении органических веществ, содержащихся в биологическом материале, серной и азотной кислотами.
В начале минерализации серная кислота играет роль водоотнимающего средства. При повышении концентрации (до 67-70 %) и температуры смеси (до 110 оС) серная кислота проявляет уже окислительные свойства, благодаря чему происходит разрушение биоматериала. Азотная кислота на первом этапе слабо окисляет органические вещества. После того, как в процессе разрушения органических веществ из азотной кислоты образуется некоторое количество азотистой кислоты и оксидов азота, азотная кислота проявляет себя, как сильный окислитель.
При использовании концентрированных кислот (азотной и серной) для разрушения биологического материала имеют место и побочные процессы. Концентрированная серная кислота может сульфатировать, а азотная – нитровать ряд органических веществ. При понижении концентрации этих кислот процессы сульфатирования и нитрования практически не происходят, поэтому разрушение биологического материала проводят не концентрированными, а частично разбавленными серной и азотной кислотами.
На первом этапе разрушения органических веществ (15-45 мин) происходит деструкция биологического материала (разрушение форменных элементов). На этом этапе нагревание колбы не должно быть сильным, так как пир сильном нагревании может происходить обильное пенообразование и выбрасывание части исследуемого материала из колбы; также может с окислами азота улетучиваться ртуть.
По окончании процесса деструкции колбу необходимо нагревать более сильно (при сильной нагревании может происходить нежелательное обугливание пробы, что приводит к потере ртути и мышьяка). Разрушение происходит в течение 3-4 часов при постепенном прибавлении азотной кислоты.
Техника минерализации.
В колбу Кьельдаля емкостью 500-800 мл вносят 100 гр измельченного исследуемого объекта, а затем добавляют 75 мл смеси, состоящей из равных объемов воды и концентрированных серной и азотной кислот. Колбу нагревают 15-40 мин, при этом реакционная смесь приобретает желтовато-соломенную окраску. После этого по каплям увеличивают нагревание и по каплям прибавляют азотную кислоту (разбавленную равным количеством дистиллированной воды). Нагревание необходимо вести таким образом, чтобы из колбы не выходили бурые пары образующихся оксидов азота. Нагревание прекращают тогда, когда жидкость просветлеет, а при дальнейшем нагревании колбы будут выделяться белые пары серной кислоты и не будет заметного потемнения жидкости. Полученный минерализат охлаждают, проверяют на наличие азотной кислоты и оксидов азота с помощью реакции с дифениламином (появление синего окрашивания). Минерализат, не содержащий азотной кислоты и оксидов азота, используют для обнаружения «металлических ядов». С помощью этого метода нельзя разрушать объекты, содержащие ртуть, так как в процессе минерализации её соединения могут улетучиваться.