Микробиологическая диагностика холеры

МАТЕРИАЛ ДЛЯИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения боль­ного, рвотные массы, вода, пищевые продукты; при постмор-тальной диагностике: отрезки тонкой кишки и желчный пу­зырь с частью печени. При необходимости хранения материал

помещают в транспортную среду (буферный солевой раствор сглицерином). Для длительного сохранения рекомендуется по­лоску фильтровальной бумаги, смоченную в жидких испраж­нениях, поместить в герметически закрытый пластиковый кон­тейнер — для предохранения от высыхания. Таким образом возбудитель сохраняется в материале до 5 нед.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование.Из исследуемого мате­риала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и вод­ным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат "висячая" капля, в котором определяют наличие по­движных вибрионов при темнопольной или фазово-контраст-ной микроскопии. Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активно-подвижных вибрионов в препарате "ви­сячая" капля позволяет дать первый предварительный положи­тельный ответ (рис. 13.3.1; на вклейке).

Бактериологическое исследование.Материал засевают в раз­личные жидкие и плотные элективные среды, в частности во флаконы со щелочной пептонной водой (1 % с теллуритом) и на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пеп­тонной воде инкубируют при 37 "С в течение 5—6 ч, на чаш­ках — 10—12 ч. Из голубоватой пленки, образующейся на пеп­тонной воде, или из ее поверхностного слоя делают мазки и препараты "раздавленная" и "висячая" капля. Этот же мате­риал используют для постановки реакции агглютинации на стекле со специфической противохолерной 01-сывороткой. Часть пептонной воды переносят в другую пробирку для по­становки нитрозоиндоловой пробы. Для этого добавляют туда же несколько капель серной кислоты. В положительном случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозоиндола под влиянием холерного вибриона. Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептон-ную воду. Наличие грамотрицательных вибрионов, агглютини­рующихся 01-сывороткой, позволяет дать второй предвари­тельный ответ. Независимо от полученных результатов продол­жают исследование, как показано на схеме 13.3.1.

Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5—6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию аг­глютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из колоний. Для этого агглютинирующую 01-сыворотку разводят в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3—4-часо­вой инкубации при 37 "С.

Идентификацию культуры проводят на основании опреде-

Схема 13.3.1. Микробиологическое исследование при холере

ления чувствительности вибрионов к холерному фагу, агглю-тинабельности противохолерной 01-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и Огава, их гемоли­тических и биохимических свойств (оксидазная активность декарбоксилазы аминокислот, ферментация углеводов, образо­вание ацетилметилкарбинола и др.).

Реакция Фогеса —Проскауэра: вибрионы выращива­ют в глюкозофосфатном бульоне, затем добавляют реактив аль-

фа-нафтол в растворе щелочи; при наличии ацетилметилкар­бинола наблюдается рубиново-красное окрашивание среды.

Гексаминовый тест: культуру выращивают на бульоне с глюкозой, гексамином (уротропином) и индикатором бромти-моловым синим. В положительном случае через 6—8 ч наблю­дается изменение зеленого цвета среды в желтый.

Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавливают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных вибрионов в реак­ции агглютинации с 01-сывороткой, по чувствительности к специфическому фагу и другими тестами; 3) определяют видо­вые признаки культур. Окончательное заключение о вьщелении и дифференцировании холерных вибрионов дают через 36—48 ч на основании комплексного изучения основных биологических признаков возбудителя (табл. 13.3.1).

Таблица 13.3.1. Тесты для дифференциации V.cholerae

Тест

V.cholerae asiatici

V.cholerae el-tor

Неагглюти- нирующиеся вибрионы

+ +

Агглютинация О-сывороткой +

Агглютинация типовыми сы- +

+ + + + + + +

воротками Огава и Инаба Лизис фагами:

+ + + + + +

холерный фаг С (фаг IV) +

фаг Эль-Тор II —

Агглютинация куриных эрит- —

роцитов

Гемолиз эритроцитов барана —

Рост на агаре с 50 ЕД поли- —

миксина

Гексаминовый тест —

Реакция Фогеса—Проскауэра —

(образование ацетилметил­карбинола)

Трудности при оценке результатов бактериологического ис­следования встречаются при выделении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не агглютинирующихся холерной 01-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут лизиро-ваться одним из специфических холерных фагов и обладать другими свойствами, сходными с холерными вибрионами.

Экспресс-методы диагностики: иммобилизация вибри­онов холерными сыворотками и типовыми холер­ными фагами. Капли испражнений или материала с поверх­ности пептонной воды обрабатывают холерной 01-сыворот-

кой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты "раздавленная" капля, которые исследуют с помощью темнопольной и фазо-во-контрастной микроскопии. В положительном случае через 3—5 мин движение вибрионов прекращается.

Иммунохимические исследования. Применяют ме­тод прямой ИФ. Мазки из исследуемого материала обрабаты­вают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и ис­следуют в люминесцентном микроскопе. Положительным ре­зультатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестя­щего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10⁶ клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное подращивание материала на питательных средах.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя спомощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Выявление антител к возбудителю являет­ся вспомогательным и применяется для ретроспективной диа­гностики холеры, выявления вибрионосителей и оценки напря­женности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РИГА, диагностический титр антител в этих реакциях 1:80—1:320, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса.

• Диагностика носительства

Во время вспышки холеры проводят массовое обследование на носительство V.cholerae.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: ректальные мазки (фекалии, взятые тампоном из прямой кишки).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование.Посев материала от 10 обследуемых на обогатительную среду с 01-агглютинирующей диагностической сывороткой. В положительных случаях через 3—4 ч начинается выпадение хлопьев в результате агглютина­ции размножившихся вибрионов. При обнаружении в осадке грамотрицательных подвижных вибрионов каждый из 10 паци­ентов обследуется индивидуально.