Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.
Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.
Иммерсионный объектив (от лат. immersio — погружение) - между фронтальной линзой объектива и объектом находится иммерсионная среда:
◦ вода (n=1,33) - водная иммерсия;
◦ глицерин (n=1,43) - глицериновая иммерсия;
◦ иммерсионное масло (n=1,51) - масляная иммерсия.
Для исключения преломления света => уменьшается величина преломляющей способности
Сфера применения: изучение окрашенных микропрепаратов.(бактериологический метод диагностики)
Достоинства
◦ Высокое разрешение
◦ Простота настройки и использования
Недостатки
Необходимость фиксации и окраски препаратов
Принцип действия:
Полезное увеличение x90. Имм. масло ↑апертуру объектива и разрешающую способность. Имеет коэффициент преломления как у предметного стекла 1.5, при этом Z = 0.2 мкм = 200 нм
Принципы классификации микроорганизмов. Понятие о виде и штамме.
Микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. Этим занимается специальная наука — систематика микроорганизмов. Систематика включает три части: классификацию, таксономию и идентификацию. В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства. Различают следующие таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны — группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам.
Микроорганизмы представлены доклеточными формами (вирусы — царство Vira) и клеточными формами (бактерии, архебактерии, грибы и простейшие). Различают 3 домена (или «империи»): «Bacteria», «Archaea» и «Eukarya»:
□ домен «Bacteria» — прокариоты, представленные настоящими бактериями (эубактериями);
□ домен «Archaea» — прокариоты, представленные архебактериями;
□ домен «Eukarya» — эукариоты, клетки которых имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком, а цитоплазма состоит из высокоорганизованных органелл — митохондрий, аппарата Гольджи и др. Домен «Eukarya» включает: царство грибы; царство животных (включает простейшие); царство растения. Домены включают царства, типы, классы, порядки, семейства, роды, виды. + Вирусы
Морфологическая классификация : кокки, палочки, извитые, нитчатые, полиморфные
Примеры : менингококк, сальмонеллы, клостридии, холерный вибрион.
Вид. Одной из основных таксономических категорий является вид (species). Вид — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода.
Чистая культура. Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами. (культура микроорганизмов одного вида)
Штамм. – чистая культура микроорганизмов, выделенная из того или иного источника(из организма или внешней среды);(чистая культура микроорганизмов, выделенная либо из разных источников, либо из одного источника в разное время)
Клон - совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.
(потомство одной клетки)
Основные группы микроорганизмов. Значение в патологии человека. Примеры.
1.Прокариота- организмы, не обладающие оформленным ядром и внутриклеточными мембранными структурами
1.1 Собственно бактерии – наиболее обширная группа паразитических и свободно живущих прокариота, обладающих жесткой клеточной стенкой (брюшной тиф; сибирская язва; газовая гангрена)
1.2 Актиномицеты – бактерии способные к образованию длинных септированных или несептированных нитей (нитчатые бактерии) (актиномикоз)
Значение в паталогии человека - многие актиномицеты используются в качестве штаммов-продуцентов при производстве антибиотиков и ферментных препаратов)
1.3 Микоплазмы – бактерии, не имеющие клеточной стенки (атипичная пневмония; урогенитальный микоплазмоз)
1.4 Риккетсии – бактерии, облигатные внутриклеточные паразиты (эпидемический сыпной тиф; клещевой риккетсиоз; пятнистая лихорадка скалистых гор; лихорадка цуцугамуши)
1.5 Хламидии – бактерии, облигатные внутриклеточные паразиты. Отличаются от риккетсий сложным циклом внутриклеточного размножения (трахома; хламидийная пневмония)
1.6 Спирохеты – спирально извитые микроорганизмы. Отличаются наличием внутриклеточных фибриллярных структур (сифилис ;лептоспироз; боррелиоз Лайма)
2. Эукариота – организмы, обладающие оформленным ядром и внутриклеточными мембранными структурами
2.1 Простейшие – одноклеточные эукариотические животные
2.2 Низшие грибы – гетеротрофные одноклеточные и многоклеточные микроорганизмы
3. Вирусы – неклеточная форма жизни
Питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.).
Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.
В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье.Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.
Требования:
1) Питательная ценность и сбалансированность
2) Стерильность
3) Оптимальное значение активности воды (0,95..)
4) Оптимальный PH (7,2-7,4)
5) Оптимальные ок-вост потенциалы
6) Оптимальное значение вязкости
-Агар Эндо (Состав: Питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)
Дифференцирующий фактор - лактоза
Индикатор - фуксин-сернистый реактив (фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия)
Принцип действия: при расщеплении лактозы в питательной среде накапливаются кислые метаболиты. В кислой среде фуксин высвобождается и окрашивает лактозоположительные колонии в красный цвет. При интенсивном кислотообразовании колонии приобретают металлический блеск
Лактозонегативные колонии бесцветные или окрашенные в цвет среды (бледно розовые)
Назначение: выделение и дифференцировка по лактозному признаку энтеробактерий)
-Кровяной Агар (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)
Дифференцирующий фактор - кровь (эритроциты); Индикатор - нет
Принцип действия: кровь является фактором роста, необходимым для многих требовательных микроорганизмов
Некоторые микроорганизмы обладают гемолитической активностью и способны образовывать колонии, окруженные зоной гемолиза.
Таким образом среда позволяет дифференцировать микроорганизмы по наличию и типу гемолиза
Назначение: выделение и дифференцировка микроорганизмов по гемолитической активности. Выделение и культивирование требовательных микроорганизмов.
- Солевой Агар (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)
Элективный фактор - 10% хлорида натрия
Принцип действия: высокая концентрация хлорида натрия подавляет рост большинства микроорганизмов. Стафилококки при концентрации соли 10% не подавляются и формируют на среде изолированные колонии.
Назначение
Выделение стафилококков с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.
- Желточно-солевой (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар) Дифференцирующий фактор - лецитин (эмульсия куринного желтка)
Элективный фактор - 10% хлорида натрия Индикатор - отсутствует
Принцип действия
Высокая концентрация хлорида натрия подавляет рост большинства микроорганизмов. Стафилококки при концентрации соли 10% не подавляются.
Наличие в среде лецитина позволяет дифференцировать стафилококки по наличию лецитовителазы. При расщеплении лецитина образуются нерастворимые продукты, выпадающие в толще среды вокруг колоний, образуя "перламутровую" зону.
Назначение
Выделение стафилококков и дифференцировка по лецитовителазному признаку (S.aureus - lec+, остальные - lec-) с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.
-Агар Плоскирева (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)
Дифференцирующий фактор – лактоза- элективный фактор - соли желчных кислот
Индикатор - нейтральный красный Принцип действия:
Соли желчных кислот подавляют рост сопутствующей микрофлоры. Поскольку полного подавления не происходит, колонии вырастающих микроорганизмов можно дифференцировать по способности расщеплять лактозу. В питательной среде накапливаются кислые метаболиты. В кислой среде нейтральный красный окрашивает лактозоположительные колонии в красный (брусничный) цвет.
Назначение
Выделение лактозонегативных патогенных энтеробактерий (сальмонеллы и шигеллы)
-Солевой бульон (Состав: питательная основа - питательный бульон (мясо-пептонный бульон)Элективный фактор - 10% хлорида натрия
Принцип действия
Высокая концентрация хлорида натрия подавляет рост большинства микроорганизмов. Стафилококки при концентрации соли 10% размножаются. Если в исходном материале стафилококков было мало, то после инкубации их концентрация увеличится и при высеве из накопительной среды на плотную мы получим рост колоний стафилококков.
Назначение
Накопление стафилококков с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.
-Сахарно-кровяной Агар (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар) Дыхательный субстрат – глюкоза Редуцирующий фактор - кровь (гемоглобин эритроцитов)
Принцип действия
Глюкоза является дыхательным субстратом, используемым анаэробами в энергетических процессах
Гемоглобин, содержащийся в эритроцитах, связывает токсичные формы кислорода, понижая окислительно-восстановительный потенциал среды
Для обеспечения роста строгих анаэробов чашки необходимо инкубировать в бескислородной атмосфере.
Назначение
Выделение чистой культуры облигатно анаэробных бактерий.
-Тиогликолевая (среда контроля стерильности) Состав
Питательная основа - питательный бульон (мясо-пептонный бульон) + 0,1% агар-агара
Дыхательный субстрат – глюкоза Редуцирующий фактор - тиоловые соединения (тиогликолят натрия и цистеин)
Принцип действия
Глюкоза является дыхательным субстратом и используется в энергетических анаэробных процессах.
Тиоловые соединения связывают токсичные формы кислорода и снижают окислительно-восстановительный потенциал среды.
Небольшое количество агар-агара повышает вязкость среды и уменьшает насыщение среды кислородом в результате конвекции.
Назначение
Накопление анаэробных микроорганизмов.
-среда Вильсона-Блер Состав питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар) Дыхательный субстрат – глюкоза Редуцирующий фактор - сульфит натрия
Индикатор - хлористое железо (индикатор на серводород)
Принцип действия
Глюкоза является дыхательным субстратом и используется в энергетических анаэробных процессах.
C.perfringens восстанавливает сульфит натрия до сульфида, который, взаимодействуя с ионами железа образует черное нераствориемое соединение - сульфид железа.
Назначение
Обнаружение сульфитредуцирующих клостридий (в первую очередь Clostridium perfringens)
Классификация питательных сред. Особенности состава и области применения. Примеры.
Классификация питательных сред
По составу
◦ Простые - содержат основные компоненты белкового питания. Используются в качестве питательной основы для приготовления сложных питательных сред
Например: пептонная вода, мясо-пептонный бульон, питательный агар
Сложные - содержат питательную основу и различные добавки: ростовые, дифференцирующие, селективные, хромогенные
Например: кровяной агар, солевой агар, селенитовый бульон
По консистенции
◦ Жидкие (бульоны) - не содержат гелеобразующих веществ
Например: солевой бульон, пептонная вода
◦ Полужидкие - содержат 0,1 - 0,7% агар-агара
Например: тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности)
◦ Плотные (агары) - содержат 1,0 - 2,0% агар-агара
Например: мясо-пептонный агар, среда Эндо...
По назначению
Дифференциальные - выделение чистой культуры микроорганизмов и одновременной дифференцировке по биохимическим (как правило) свойствам (диф фактор, индикатор, пит основа(МПА, лактоза, осн фуксин)
Например: среда Эндо, кровяной агар
Элективные - предназначены для подавления роста сопутствующей микрофлоры с целью облегчения выделения целевого микроорганизма в чистой культуре.
Например: солевой агар
Элективно-дифференциальные - предназначены для выделения чистой культуры микроорганизмов и одновременного подавления роста сопутствующей микрофлоры. Вырастающая сопутствующая микрофлора дифференцируется от целевых микроорганизмов по биохимическим свойствам. (МПА, элективный фактор, диф фактор и индикатор)
Например: желточно-солевой агар, агар Плоскирева
Обогатительные - увеличение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале, с последующем выделением чистой культуры путем высева на плотную среду. В зависимости от характеристики исследуемой пробы обогатительные среды могут обладать селективностью или быть неселективными (МПБ, обогат фактор)
Например: сахарный бульон, солевой бульон
Синтетические - состоят из химически чистых компонентов, что позволяет создавать строго контролируемые условия роста. Предназначены для изучения метаболизма (аксотрофы и прототрофы), генетических экспериментов и т.п (вода, глюкоза и мин соли/орг молек)
Например: агар М9
Среды для анаэробов - выделение и культивирование строгих анаэробов (глюкоза + ред фактор)
Например: анаэробный кровяной агар, тиогликолевая среда, среда Вильсона-Блер
Достоинства
· Высокая эффективность
· Широкий перечень стерилизуемых объектов
· Минимальное повреждение стерилизуемых объектов
· Возможность стерилизации упакованных изделий
Недостатки
◦ Аппаратура работает под повышенным давлением
◦ Возможна коррозия металлических объектов
Воздушная стерилизация
В воздушных стерилизаторах осуществляют стерилизацию сухим нагретым воздухом. Поскольку стерилизующий эффект сухого воздуха значительно слабее, чем у насыщенного пара. испольхуются волее высокие температуры (160 - 180 0С) и длительные экспозиции (60 - 120 мин). Для равномерного прогрева воздушные стерилизаторы имеют встроенный вентилятор.
Использование:
Стерилизация стеклянной посуды, термостабильных порошков, металлических инструментов.
Достоинства
◦ Простота управления
◦ Низкие эксплуатационные расходы
◦ Возможность упаковки стерилизуемых объектов
Недостатки
◦ Ограниченный перечень стерилизуемых объектов
◦ Большая продолжительность цикла стерилизации
Прокаливание в пламени
Газовые горелки и спиртовки используют для стерилизации открытым пламенем. В случаях, когда невозможно применить открытое пламя, возможно использование инфракрасных нагревателей.
Использование:
Стерилизация мелких металлических инструментов: бактериологические петли, препаравальные иглы, пинцет...
Достоинства
◦ Практически мгновенная стерилизация
Недостатки
◦ Нельзя хранить простерилизованный инстумент
◦ Только для мелких инструментов
◦ Пожароопастность
Газовая стерилизация
Низкотемпературный метод стерилизации, с использованием окиси этилена. Данный газ обладает хорошими микробоцидными свойствами и проникающей способностью.
Достоинства
◦ Возможность стерилизации объектов, не выдерживающих высокие температуры
◦ Надежная упаковка стерилизуемых изделий
◦ Высокая надежность стерилизации
Недостатки
◦ Очень высокая токсичность газа
◦ Необходимость длительного проветривания простерилизованных объектов
Плазменная стерилизация
Стерилизация проводится парами 60% раствора Н2О2 и низкотемпературной плазмы. Это делает данный метод универсальным, поскольку позволяет обрабатывать любые изделия, в том числе и волоконную оптику. Перед стерилизацией изделия должны быть упакованы в специальную упаковку.
Достоинства
◦ Универсальность
◦ Низкая температура стерилизации
◦ Высокая эффективность стерилизации
◦ Экологически безопасный метод (конечные продукты - Н2О и О2)
Недостатки
◦ Высокая стоимость оборудования
Необходимость специальной упаковки (обычные упаковочные материлы не годятся)
Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.
Иммерсионный объектив (от лат. immersio — погружение) - между фронтальной линзой объектива и объектом находится иммерсионная среда:
◦ вода (n=1,33) - водная иммерсия;
◦ глицерин (n=1,43) - глицериновая иммерсия;
◦ иммерсионное масло (n=1,51) - масляная иммерсия.
Для исключения преломления света => уменьшается величина преломляющей способности
Сфера применения: изучение окрашенных микропрепаратов.(бактериологический метод диагностики)
Достоинства
◦ Высокое разрешение
◦ Простота настройки и использования
Недостатки
Необходимость фиксации и окраски препаратов
Принцип действия:
Полезное увеличение x90. Имм. масло ↑апертуру объектива и разрешающую способность. Имеет коэффициент преломления как у предметного стекла 1.5, при этом Z = 0.2 мкм = 200 нм