Изучение биохимических свойств микроорганизмов
Ферментация источников углеводов. Сахаролитическую способность бактерий проверяют на средах, содержащих 1% углеводов по изменению рН. Углеводы добавляют к среде Гисса. Во избежание внесения в среду с инокулятом небольших количеств сахаров в качестве посевного материала используют одну петлю густой суспензии бактерий. Посевы инкубируют 36–96 ч при 30 – 37 ° С температуре. Для испытания на присутствие кислоты индикатор добавляют в среду после инкубирования. В качестве индикатора используют индикатор бромтимоловый синий (0,04 %).
Определение фермента каталаз. На поверхность микробной культуры, выращенной на плотной питательной среде в чашке Петри, наносят 1–2 см3 3 % раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы.
Определение наличия оксидаз. Выросшие колонии с дифференциально-диагностических сред петлей переносят на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченной реактивом для определения оксидазной активности. Через 2–5 мин. достаточно четко проявляется положительная реакция – сине-фиолетовая окраска ободка или всей колонии.
Нитратредуцирующая способность. Действие бактерий на нитраты обнаруживают по исчезновению нитратов из среды и появлению нитритов, аммиака или свободного азота. Для инокуляции регенерированной и охлажденной мясо-пептонной среды с нитратами используют петлю густой суспензий бактерий. Посевы термостатируют при температуре 30 – 37 ° С и просматривали на наличие роста после 24, 48 и 72 ч. После чего 1 см3 культуральной жидкости переносят в пробирку и добавляют реактив Грисса (через 15–20 мин получалось розовое окрашивание).
Определение цитратного признака. Посев производят уколом в глубину столбика агара Симмонса. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 оС 18–20 ч. Цитрат-положительные бактерии изменяют зеленый цвет среды на синий.
Определение продукции индола. Определение продукции индола проводили на агаре Симмонса. На поверхность среды наслаивают 0,1–0,2 см3 реактива-Ковача. В течение первых 5 мин индолположительные микроорганизмы дают малиновое окрашивание кольца.
Определение сероводород. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном. После чего в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. Образующийся в культуре сероводород придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.
Реакция с метиловым красным. Посев производят в 1 см3 среды Кларка, а затем инкубируют в течение 24 ч и более при 37 °С. После инкубации прибавляют 0,1–0,2 см3 реактива Кларка. Покраснение среды указывает на прекращение микробного метаболизма в результате резко кислой реакции среды (положительная реакция); желтый цвет свидетельствует о продолжающемся метаболическом процессе и подщелачивания среды за счет расщепления пептона (отрицательная реакция).
Реакция Фогеса-Проскауера (наличие ацетоина) К бактериальной культуре прибавляют 0,2–0,3 см3 реактива Баррита и 0,1 см3 40 % водного раствора КОН. Появление на поверхности среды кольца окраски разной степени интенсивности – от розового до ярко-красного в течение от 5–10 мин до 2 ч указывает на продукцию ацетоина.
Гидролиз мочевин. Посев микроорганизмов производят уколом в глубину столбика среды с мочевиной Кристенсена для определения уреазной активности. Посев инкубируют в термостате при температуре 37 оС от нескольких часов до 4 сут. При положительном результате среда из желтоватой становится красной.
Определение желатиназной активности. Среду для определения желатиназной активности разливают в пробирки столбиком по 5–6 см3. Посев бактерий производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Посевы инкубируют при двух температурах (20…22 и 37 °С). Если под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды.
Определение декарбоксилаз лизина, аргинина, орнитина. Колонии микроорганизмов вносят в глубину среды для определения декарбоксилаз аминокислот. Посев инкубируют при температуре 37 оС от нескольких часов до 1 сут. При расщеплении аминокислот цвет среды становится из желтого синим. Цвет контрольной среды остается желтым.
Определение фенилаланиндезаминазы. Колонии микроорганизмов вносят в глубину среды для определения фенилаланиндезаминазы. Содержимое пробирки перемешивают. Посев инкубируют в термостате при температуре 37 оС от нескольких часов до 1 сут. В случае образования фенилпирувиновой кислоты поверхность агара приобретает зеленый цвет.
Липазная активность. Для определения липазной активности (титрометрическим методом) в сухую колбу вноят 1,3 см3 оливкового масла, добавляют 1 см3 физиологического раствора и интенсивно перемешивают. В ту же колбу добавляют 3 см3 культуральной жидкости или клеток микробов, суспендированных в 1,5 см3 дистиллированной воды. Содержимое колбы встряхивают 2–3 мин и помещают в термостат на 18 ч в условиях покоя. По окончании добавляют 15 см3 этанола (для предотвращения гидролитической диссоциации мыла) и 12,5 см3 серного эфира (для разрушения эмульсии). Полученную смесь титруют 0,1 н. NaOH с тимолфталеином. Липазную активность определяют по количеству (в см3) 0,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование образовавшихся жирных кислот; 1 см3 щелочи соответствует 500 условным единицам липазной активности.
Видовой состав бактерий, их численность позволяет судить об интенсивности, как процессов загрязнения, так и процессов самоочищения. Таксономический состав выделенных из проб воды бактерий может показать характер вносимых в водоем загрязнений, поскольку аллохтонные бактерии развиваются при появлении доступного субстрата. Метод позволяет зарегистрировать многих представителей бактероценоза, что в свою очередь позволить судить о его структуре и направленности пищевых процессов в водоеме. Метод не требует дорогостоящего оборудования, достаточно достоверный при выделении наиболее хорошо изученных и часто встречающихся в водных экосистемах родов бактерий. Однако, весьма трудоемкий и громоздкий.
КРИТЕРИИ И ШКАЛА ОЦЕНИВАНИЯ
| Оценка | Критерии оценки |
| Отлично | Правильность выполнения задания на лабораторную работу в соответствии с вариантом; высокая степень усвоения теоретического материала по теме лабораторной работы. Способность продемонстрировать преподавателю навыки работы в инструментальной программной среде, а также применить их к решению типовых задач, отличных от варианта задания. Высокое качество подготовки отчета по лабораторной работе. Правильность и полнота ответов на вопросы преподавателя при защите работы. |
| Хорошо | Демонстрирует достаточно высокий/выше среднего уровень выполнения задания на лабораторную работу в соответствии с вариантом и хорошую степень усвоения теоретического материала по теме лабораторной работы. Все требования, предъявляемые к работе, выполнены. |
| Удовлетворительно | Демонстрирует средний уровень выполнения задания на лабораторную работу в соответствии с вариантом. Большинство требований, предъявляемых к заданию, выполнены. |
| Неудовлетворительно | Демонстрирует низкий/ниже среднего уровень знаний, умений, навыков в соответствии с критериями оценивания. Многие требования, предъявляемые к заданию, не выполнены. |
Зависимость баллов в БРС университета за выполнение и защиту лабораторной работы от оценки в традиционной шкале «отлично-хорошо-удовлетворительно-неудовлетворительно» можно представить в таблице.
| Оценка | отлично | хорошо | удовлетворительно | неудовлетворительно |
| Баллы в БРС |
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная литература:
1. Белясова, Н.А. Микробиология. – М.: Высш. Шк, 2012.
2. Богданова, О.Ю. Микробиология водных экосистем: учеб. пособие для студентов/ О.Ю. Богданова. - Мурманск: Изд-во МГТУ, 2016.
3. Госманов Р.Г. Микробиология: Учеб. для студ. и вузов /Р.Г.Госманов и др. – СПб, Москва, Краснодар: Издательский центр «Лань», 2011.
4. Госманов Р.Г. Санитарная микробиология: Учебное пособие /Р.Г.Госманов, А.Х.Волков, А.К.Галлиулин, А.И.Ибрагимова. – СПб, Москва, Краснодар: Издательский центр «Лань», 2010.
5. Нетрусов, А.И. Микробиология. Учебник/ А.И. Нетрусов, И.Б.Котова. – М.:Академия, 2012.
6. Перетрухина А.Т., Луценко Е.С. Микробиологический и вирусологический мониторинг Кольского залива и водных экосистем г. Мурманска: монография под ред. А.Т. Перетрухиной. – Мурманск: изд-во МГТУ, 2011.
7. Перетрухина, А.Т. Гидросфера как среда обитания. Учебное пособие/А.Т. Перетрухина, О.Ю. Богданова, В.Е. Осауленко. – Мурманск: Изд-во МГТУ, 2013.
8. Широкая, Т.А. Гидрохимические исследования бассейна Кольского залива: Учебное пособие/Т.А.Широкая, С.И.Овчинникова. – Мурманск: Изд-во МГТУ, 2011.
Дополнительная литература:
1. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология : учеб. – М.: ОО Мед.информ.агентство, 2001.
2. Вербина, Н.М. Гидромикробиология с основами общей микробиологии / Н.М. Вербина. – М.: Пищ.пром-ть, 1980.
3. Жизнь микробов в экстремальных условиях : под ред. Д. Кашнера.- М.: Мир, 1981.
4. Заварзин, Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии /Г.А. Заварзн. – М.: Наука, 2004.
5. Емцев, В.Т. Микробиология: учебник для студ. вузов/В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – 6-е изд., испр. – М.: Дрофа, 2006.
6. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. – М. : СпецЛит, 2002. – 350 с.
7. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. – М.: МГУ, 1987.
8. Макаревич, Е.В. Гидромикробиологический контроль сточных вод. Методические указания /Е.В. Макаревич, М.Ю.Литвинова. - Мурманск: Изд-во МГТУ, 2008.
9. Нетрусов, А.И. Общая микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений/А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. – М.: ИЦ «Академия», 2007.
10. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др. – Москва: Мир, 2007.
11. Руководство по методам биологического анализа морской воды и донных отложений : под ред. А. И. Цыбань.- Л.: Гидрометеоиздат, 1980.
12. Федоров В.Д., Капков В.И. Практическая гидробиология: Пресноводные экосистемы. – Москва: ПИМ, 2006.
РЕЦЕНЗИЯ
на методические указания к лабораторным работам студентов по дисциплине «Гидромикробиология» для направления 06.03.01 «Биология», профиль «Микробиология»
Составители: И.В. Ускова, к.б.н., доцент кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО МГТУ; Блинова Е.И., старший преподаватель кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО МГТУ
Методические указания составлены в соответствии с ФГОС ВО по направлению 06.03.01 «Биология», а также рабочей программой по дисциплине «Гидромикробиология».
В результате изучения теоретического материала и освоения курса лабораторных работ по дисциплине «Гидромикробиология» студенты получат знания о водных экосистемах, о функционировании бактериоценозов водных экосистем, об особенностях физиологических групп микроорганизмов, роли микроорганизмов в круговороте органических веществ в водоемах, а также ознакомятся с основными современными методами изучения водных микробиоценозов.
Рецензируемые методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Гидромикробиология» будут способствовать систематизации и закреплению студентами полученных знаний.
Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Гидромикробиология» для направления подготовки 06.03.01 «Биология» составлены в соответствии со всеми необходимыми требованиями и рекомендуются для издания через ИПЦ ФГБОУ ВПО МГТУ.
| Канд. биол. наук, научный сотрудник кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО МГТУ | Мирошниченко Е.С. |