Радиальная иммунодиффузия по манчини
В 1965 г. Джульетта Манчини и соавт., а независимо от них - Д.Л. Фэй и Э.М. МакКелви разработали методику радиальной иммунодиффузии (РИД) в том же агаровом геле для количественного определения содержания в крови (в сыворотке) иммуноглобулинов классов А, G и М.
Для этого потребовалось получить моноспецифические антисыворотки лабораторных животных против очищенных иммуноглобулинов классов М, А и G человека. Моноклональных антител в те годы еще не было.
Манчини, Фэй и МакКелви воспользовались тем физикохимическим свойством агар-агара, что температура его плавления недалека от физиологических температур теплокровных животных, и белки (по крайней мере иммуноглобулины) не претерпевают калечащую денатурацию при температуре плавления агара. Это позволило авторам ввести в состав золя агара, т.е. в жидкую фазу, антисыворотки против иммуноглобулинов разных изотипов, тщательно перемешать раствор перед заливанием на стеклянную пластину. Таким образом, в слое агарового геля оказываются заплавленными антииммуноглобулиновые антиизотипические антитела. В таком геле пробивают круглые луночки, в которые вносят так называемые стандарты (или калибраторы, т.е. растворы иммуноглобулинов с известной концентрацией для построения калибровочной кривой) и пробы испытуемых сывороток и оставляют на свободную диффузию на 16-24 ч.
По истечении этого времени вокруг луночек образуются видимые невооруженным глазом кольца преципитатов. Опыт показал: диаметр колец преципитатов тем больше, чем выше концентрация данного изотипа иммуноглобулинов в исследуемой биопробе. Калибраторы - препараты иммуноглобулинов заданного изотипа с известной весовой концентрацией (мг/мл) - позволяют построить калибровочную кривую и с ее помощью определить концентрации иммуноглобулинов в испытуемых пробах сывороток. Последнее возможно только на прямом отрезке кривой. Для спрямления калибровочной кривой прибегают к несложным математическим действиям, например откладывают на осях координат не диаметр колец преципитации, а квадрат этой величины, и/или не концентрацию изотипа иммуноглобулинов, а логарифм концентрации по основанию 2 или 10. Какой подход окажется приемлемым, подбирают опытным путем в каждой лаборатории.
Хотя метод РИД разработан полвека назад, его нередко используют в лабораториях клинической иммунологии до настоящего времени в силу простоты исполнения, относительно невысокой стоимости реагентов и независимости от приборов.
Метод РИД применим только для названных изотипов иммуноглобулинов (М, А и G), ибо их физиологические концентрации в сыворотках крови попадают в пределы чувствительности метода (мг/мл).
Изотипы IgD и IgE присутствуют в нормальных сыворотках в таких низких концентрациях, которые метод РИД не «видит». Концентрации IgE определяют с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа - ИФА (см. ниже):
1) общий IgE - ловушечным ИФА, в котором первым слоем на твердой фазе сорбированы моноклональные антиизотипические анти-ε-антитела;
2) для определения антигенспецифичных IgE антигены сорбируют на пористой твердой фазе, где площадь сорбции существенно превосходит дно планшета при одном и том же реакционном объеме; чувствительность определения соответственно существенно выше.
IgD в норме присутствует в сыворотках в следовых количествах, и задача его измерения встает крайне редко (вероятно, только в случаях IgD-продуцирующих плазмоцитом).
В табл. 4.1 и 4.2 приведены нормальные концентрации иммуноглобулинов разных изотипов у людей разного возраста (по данным более современного нефелометрического определения с использованием антиизотипических моноклональных антител и прибора нефелометра).
Таблица 4.1.Концентрации иммуноглобулинов классов М, А и G в сыворотке крови человека в норме
Окончание табл. 4.1
Таблица 4.2.Концентрация изотипов IgG (1, 2, 3, 4), IgA (1, 2) и IgE в сыворотке крови взрослого человека в норме
Поскольку IgE в норме в крови присутствует в низкой концентрации, то для снижения вероятности ошибок при записывании нулей по международной договоренности значения IgE выражают в так называемых международных единицах - МЕ/мл или кМЕ/л (IU/ml, kIU/l). 1 МЕ равна 2,43 нг IgE.
Лабораторная работа 4-1