Непосредственная постановка реакции
1. Забивают мышей и фиксируют их на столике.
2. Выделяют селезенку.
3. Готовят суспензию клеток в 3 мл среды 199 и подсчитывают число ядросодержащих клеток в суспензии.
4. Готовят разведение клеток с концентрацией 50x106 и 10x106 в 1 мл.
5. Готовят смесь агара, эритроцитов барана и клеток селезенки. Для этого в пробирки с 2 мл агара, находящиеся в водяной бане при 45 °С, добавляют 0,1 мл 10% суспензии эритроцитов барана и 0,1 мл суспензии клеток (конечная концентрация клеток - 5x106 и 1x106).
6. Разливают смесь в чашки Петри. Смесь из пробирок выливают на теплые чашки Петри. Быстрыми круговыми движениями смесь равномерно распределяют по дну чашки. Чашки ставят на горизонтальный столик. Дают агару застыть.
7. Инкубируют чашки Петри в термостате при 37 °С в течение 60 мин.
8. Разведение комплемента: сухой комплемент морских свинок разводят средой 199 (на 1 ампулу 5 мл среды, получают 20% раствор).
9. В каждую чашку Петри аккуратно добавляют по 3 мл комплемента.
10. Инкубируют чашки Петри в течение 30 мин при 37 °С.
11. Оценивают реакцию.
12. Подсчитывают число бляшкообразующих клеток на чашку и пересчитывают на 1 млн клеток и на всю селезенку.
13. Микроскопия бляшек: находят бляшку с лизированным участком и бляшкообразующей клеткой в центре.
14. Для улучшения контрастирования бляшек производят окраску препаратов (состав красителя: 10 мл 2% раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте, 10 мл 5% H2O2, 80 мл дистиллированной воды).
15. Для сохранения бляшек чашку Петри заливают 10% раствором формалина.
3.5. КУЛЬТУРА КЛЕТОКIN VIVO
Метод колониеобразования кроветворных клеток в селезенке облученных мышей
После атомной бомбежки авиацией США японских городов Хиросимы и Нагасаки 6 августа 1945 г. перед мировой медициной встали проблемы защиты человека от лучевой болезни. Начала интенсивно развиваться новая наука - радиобиология. Во всех странах, в том числе в СССР, исследователи вскоре выяснили основные патологические проявления, вызванные проникающим лучевым поражением экспериментальных животных, и начали интенсивный поиск методов предупреждения и лечения лучевой болезни. Экспериментальные исследования показали: наиболее радиочувствительны гемопоэтические стволовые клетки, лимфоциты и клетки других кроветворных ростков. Облучение в 850-1000 Рад (≈10 Gy в современных единицах измерения) определили как «кроветворные летальные дозы». После такого облучения регенерация кроветворной ткани невозможна, но в течение ближайших дней (максимум 2 нед) экспериментальные мыши способны выживать за счет функционирования зрелых гемопоэтических клеток. При облучении в дозах выше 10 Gy наступает так называемая кишечная смерть за 1-3 сут, при еще более высоких дозах радиации возможна «смерть под лучом».
Единственным более или менее надежным средством спасения экспериментальных животных при облучении в «кроветворной летальной дозе» оказалась трансплантация клеток костного мозга от сингенных доноров. С тех пор облученные в «кроветворной летальной дозе» и сохранившие жизнеспособность в течение определенного срока мыши обозначаются лабораторным термином «живые пробирки». Трансплантация внутривенно таким мышам сингенных или аллогенных донорских костно-мозговых, селезеночных либо других лимфоидных клеток дает возможность в течение достаточного количества дней исследовать не только процессы приживления или неприживления вводимых клеток, но и явления взаимодействия разных типов клеток между собой. Более точно «живые пробирки» стали определять как «культуру клеток in vivo». Именно использование культуры клеток in vivo (рис. 3.7, см. также цв. вклейку) позволило сделать целый ряд открытий, актуальных до настоящего времени (взаимодействие Т- и В- лимфоцитов, роль В-клеток в антителообразовании, способность гемопоэтических клеток-предшественников к колониеобразованию in vivo и др.). Благодаря полученным данным
позже появился термин «Т-лимфоциты хелперы» (англ. to help - помогать). Т-лимфоциты рассматривали как необходимые помощники В-лимфоцитов в антителопродукции.
Рис. 3.7.Схема культуры клеток in vivo
Следует отметить: подавление гемопоэза и иммунопоэза вызывается не только лучевым поражением, но и введением в высоких дозах химиопрепаратов со свойствами цитостатиков и иммунодепрессантов (метотрексат, 6-меркаптоэтанол, циклофосфамид и др.).
Сведения о закономерностях поведения гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток в условиях экспериментальных моделей in vivo оказались актуальными для современной медицины. В последние годы все большее распространение получают методы клеточной биотехнологии в лечении многих заболеваний человека. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток нашла достаточно широкое применение не только в лечении лучевой болезни, но и целого ряда заболеваний, в первую очередь генетически опосредованных первичных иммунодефицитов, различных форм лейкозов.
В 1961 г. появилась публикация канадских ученых J.E. Till и E.A. McCulloch, в которой был представлен новый метод изучения кроветворных клеток-предшественников. Летально облученным (850-950 Рад) мышам-реципиентам трансплантировали внутривенно донорские клетки костного мозга. Через 7-10 сут на поверхности селезенки возникали видимые невооруженным глазом узелки-колонии (рис. 3.8), которые, как показал гистологический анализ, состояли из дифференцированных кроветворных клеток эритроидного, миелоидного или мегакариоцитарного ростков. Некоторые колонии отличались смешанным типом, но никогда не образовывались лимфоидные колонии. Авторы продемонстрировали прямую зависимость между числом трансплантированных донорских кроветворных клеток в
определенном диапазоне доз и числом сформировавшихся в селезенке реципиентов колоний.
Рис. 3.8.Колониеобразующие единицы (КОЕс) в селезенке мышей
Метод Тилла и MакКуллоча получил распространение как количественный способ клонирования кроветворных клеток в селезенке летально облученных мышей. В течение ряда лет клетки, дающие начало колониям, считали стволовыми кроветворными клетками (СКК). Но позже авторы и вслед за ними другие исследователи осторожно обозначили эти клетки как колониеобразующие (КОЕс). Скорее всего КОЕс - мультипотентные клетки-предшественники, отстоящие на несколько этапов дифференцировки от СКК.
Метод Тилла и MакКуллоча использовали и до сих пор используют многие исследователи во многих лабораториях мира для изучения закономерностей приживления донорских кроветворных тканей в организме облученных реципиентов.
Р.В. Петров и Л.С. Сеславина, применяя данную экспериментальную систему, в 1967 г. обнаружили и в 1977 г. зарегистрировали как открытие явление взаимодействия между СКК и лимфоцитами. Суть открытия заключалась в том, что аллогенные лимфоциты инактивировали стволовые клетки. Не исключено, что инактивирующее или тормозящее действие лимфоцитов распространяется и на другие
несингенные активно пролиферирующие клетки (раковые, эпителиальные и др.), способные обеспечить за счет размножения самоподдерживающуюся популяцию. Данный феномен может являться одним из главных механизмов иммунологического надзора и элиминации соматических мутаций (Петров Р.В., 1987).
Вопросы и задания
1. Какими методами можно оценить фагоцитоз и его завершенность?
2. Перечислите типы клеточной цитотоксичности.
3. Как оценить функциональную активность NK?
4. Как оценить цитотоксические Т-клетки?
5. Опишите основные принципы иммуномагнитной сепарации.
6. Приведите принцип работы и устройство проточного цитофлуориметра.
7. Что отражает спонтанная и индуцированная хемилюминесценция?
8. Дайте определение и приведите основные этапы культуры клеток in vivo.
9. Какие основные иммунологические феномены были изучены с помощью культуры клеток in vivo?
10. Назовите методы, выявляющие АОК.
11. Каковы особенности метода Н. Йерне?
12. Опишите закономерности антителообразования.
13. Каковы постановка реакции и методы оценки?
Глава 4 Иммуноанализы
Термин «иммуноанализ» в международной литературе применяют не к любым методам исследований, используемым в иммунологии, а только к тем, в которых ключевыми взаимодействующими субстанциями являются исходно растворимые «антиген» (или лиганд) и «антитело». В более чем 99% современных тест-систем иммуноанализов один из компонентов (либо антиген, либо антитело) сорбирован на твердой фазе, но сорбированы они из исходно растворимого состояния.
Область применения иммуноанализов широка, но чаще их используют с диагностическими целями практически во всех отраслях медицины, а также в ветеринарии и биологии. Нередко иммуноанализы находят совершенно необычное применение. Например, итальянские виноделы для осветления вина марки «мерло» используют пшеничную муку. Полученный винный продукт может содержать пшеничный глютен, опасный для больных целиакией. Иммуноанализы позволяют выявить присутствие глютена и забраковать такое вино.
В 20-30 гг. ХХ века (после работ Ф. Обермейера, Е.П. Пика, К. Ландштейнера и других ученых, получавших антитела к искусственно синтезированным антигенам) к антителам стали относиться как к высокоспецифическим реагентам, избирательно связывающим то или иное вещество, способное быть антигеном при иммунизации животных.
Чтобы лучше понять суть методов иммуноанализов, полезно осознать их отличие от иных исследований, применяемых в современной иммунологии. В фундаментальных исследованиях по иммунологии используют фактически все известные в биологических науках методы. Самые современные - методы молекулярной биологии и молекулярной генетики. В прикладной клинической иммунологии методическая база не столь широка. По сути иммунологическими называют такие методы, в которых так или иначе визуализируются реакции «антиген-антитело».
Антитела - растворимые молекулы белков. Антигены бывают разные (корпускулярные, растворимые, нерастворимые), но далеко не все видны невооруженным глазом (как, например, эритроциты в реакциях
гемолиза или агглютинации). Связывание двух растворимых молекул часто приводит к образованию также растворимого иммунного комплекса, следовательно, невидимого глазом. Поэтому с технической стороны разные тест-системы иммуноанализа различаются между собой средствами визуализации факта связывания антитела с антигеном. С 1948 г. и до конца 1960-х гг. методы визуализации комплексов антиген-антитело представляли собой преципитацию в геле (методы Оухтерлони, Манчини, варианты иммуноэлектрофореза в геле), т.е. выпадение этих комплексов в осадок, а также гемолиз или гемагглютинацию с использованием хорошо видимых эритроцитов, на поверхность которых сорбировали либо антиген, либо (реже) антитела.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕЦИПИТАТОВ АНТИТЕЛ С АНТИГЕНАМИ В ГЕЛЕ