Биологические и социальные аспекты генетической экспертизы
В недалеком будущем ни одно из уголовных или гражданских дел не будет обходиться без генетической экспертизы, так как круг задач, которые она позволяет решить, очень широк. Установление родства в делах о наследстве или назначение алиментов при спорном отцовстве, гибель в катастрофах и террористических актах, - к сожалению, не самые редкие события в сегодняшней жизни. Что же такое генетическая экспертиза и на какие вопросы она позволяет дать ответ?
При оплодотворении ребенок получает 23 хромосомы от матери и 23 хромосомы от отца. Каждая хромосома – это нитка молекулы ДНК, на которую, образно говоря, «нанизаны» локусы (участки молекулы), а локус состоит из аллелей (различной последовательности нуклеотидов). В каждом локусе может быть два аллеля: один наследуется от матери, другой – от отца. Вероятность того, что у двух различных людей они могут совпасть, практически ничтожна. Исключение составляют только однояйцевые близнецы, а также гипотетические клоны людей.
В основе экспертизы по установлению отцовства лежит выявление частоты встречаемости аллеля отца (матери) в геноме ребенка. Для определения вероятности (в криминалистике ее называют инкриминирующей вероятностью – ИВ) генетики используют формулу Байеса: ИВ = 1/(1+Q), где Q – статистическая частота отцовского аллеля, выявленного в геноме ребенка.
Строго говоря, методика ДНК-тестирования направлена на установление числа мужчин в данной популяции, которые могли иметь такие же генетические признаки, как и предполагаемый отец, и соответственно являться отцами данного ребенка. То есть если экспертиза установила, что мужчина является отцом ребенка на 99,99 проц., это значит, что на 10 тыс. человек будет один, который имеет такие же генетические признаки, как и у исследуемого мужчины, и может быть отцом данного ребенка. Но в то же время среди 10 млн. человек (население крупного города) может найтись 1 тыс. предполагаемых отцов.
Установить отцовство с точностью всех 100 проц. нереально, поскольку необходимо было бы исследовать целиком геномы матери, отца и ребенка, а это сумасшедший по объему материал! Увеличивая число изучаемых аллелей вероятность можно довести до 99,99999, но никак не 100 процентов. Кроме того, практика показала, что проще установить отцовство по отношению к мальчику или материнство по отношению к девочке и сложнее доказать родство отца с дочерью или матери с сыном. При подтверждении отцовства (материнства) по отношению к мальчику (девочке) анализируются различные участки ДНК, так как от матери ребенок получает одни гены, а от отца – другие. Как мы упоминали ранее, от отца к сыну передается мужская Y-хромосома. Поэтому отцовство мальчика определяется по сравнительному анализу именно этих хромосом. У девочек (у всех особей женского пола) Y-хромосома отсутствует, и приходится анализировать множество других (неполовых) хромосом отца и его предполагаемой дочери. Отсюда сама процедура идентификации подобных генетических меток значительно усложняется. Как поступить, если родители предполагают, что их ребенок был перепутан с другим в роддоме? Иногда возникают и такие курьезные случаи, когда необходимо проверить мать на предмет материнства.
Геном человека включает в себя две части – это хромосомную ДНК, которая находится в ядре клеток организма, а также так называемую митохондриальную ДНК. Последняя была расшифрована только в 1981 году и находится в митохондриях – крошечных органеллах, «плавающих» в цитоплазме клеток (то есть вне клеточного ядра). Митохондриальную ДНК ребенок наследует исключительно от своей матери, поэтому при установлении материнства по отношению к девочке рассматривают именно эту составную часть генома. В случае определения материнства по отношению к мальчику приходится, опять же, прибегать к более трудоемкой работе сравнения участков хромосомной ДНК. Процедура сдачи генетического материала на тест очень проста. Как правило, берется соскоб тканей со слизистой оболочки щеки с помощью ватного тампона либо несколько капель крови.
В основе применяемого молекулярно-генетического идентификационного анализа лежит определение полиморфизма длины амплифицированных фрагментов высокополиморфных генетических локусов мини- и микросателлитной природы. При их амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) образуются фрагменты, которые у каждого человека имеют различную длину и потому оказываются индивидуально специфичными. Наследуются эти локусы, как простой менделевский кодоминантный признак, что создает основу для индивидуализации и идентификации личности и установления, таким образом, биологических родственных связей данного индивидуума с другими лицами (например, установление фактов отцовства или материнства).
Важно отметить, что подобные задачи в практике судебно-медицинской экспертизы ранее решались путем определения групповых антигенов многочисленных и весьма разнообразных эритроцитарных, сывороточных, ферментных и лейкоцитарных систем крови. На практике это позволяло лишь исключить ответчика как предполагаемого отца ребенка и то не во всех случаях.
Применение молекулярно-генетического анализа позволяет с высокой степенью достоверности (не менее 99,75 %) как подтвердить, так и исключить наличие родственных связей индивидуумов.
Уникальность каждого человека определяется уникальностью его генома или, что по сути одно и то же, ДНК, являющейся хранилищем генетической информации. Помимо одинаковых практически у всех людей участков ДНК, кодирующих белки, существуют вариабельные участки, представляющие собой тандемные повторы с изменяющимся числом копий, обнаруживающие многоаллельный полиморфизм по количеству мономеров.
Аллелем называется возможная последовательность ДНК в одной и той же точке, т.е. применительно к повторам это означает, что у разных людей в одном и том же участке ДНК может встречаться различное количество мономерных единиц. Такой единицей может быть как один повторяющийся несколько раз нуклеотид, так и несколько десятков нуклеотидов, образующих тандемный ряд. Сочетания различных аллелей по нескольким повторам (локусам), лежащим на разных хромосомах, образуют генотип, характеризующий каждого человека. Чем больше маркеров анализируется в совокупности, тем больше вероятность уникальности такого сочетания, особенно, если каждый из маркеров обладает большим спектром возможных признаков (аллелей). В качестве объекта для выделения ДНК можно использовать любой биологический материал. Причем для идентификации достаточно совсем небольшого количества материала.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет амплифицировать ("умножать") интересующие исследователя участки ДНК в миллионы раз, так что даже нескольких клеток в анализируемом образце будет достаточно для типирования (определения совокупности аллелей). В настоящее время существует несколько систем для типирования образцов ДНК, используемых для идентификации личности и установления биологического родства, но наиболее распространенной является система из 13 маркеров - CODIS (COmbined DNA Index System), созданная в 1991 году в США.
Она включила в себя системы, используемые к тому времени в Интерполе, стандарт Европейской системы судебно-научных институтов из 7 маркеров и систему судебных генетиков стран Южной Америки из 6 маркеров, из которых только 1 являлся общим с Европейской. Необходимость возникновения такой системы была обусловлена несколькими основными положениями: во-первых, требовались данные по частотам аллелей для разных популяционных групп; во-вторых, предполагалось создание единой для всех штатов базы данных, хранящей информацию обо всех тяжких преступлениях и дающей возможность в будущем идентифицировать как жертву, так и преступника.
В 1994 году девятнадцать штатов Америки объединили свои данные и начали работать по единому стандарту. С появлением многоцветных флуоресцентных анализаторов фирмой Promega (USA) был создан набор PowerPlex16, в который помимо маркеров, составляющих CODIS, вошел амилогенин-маркер, по которому возможно определить пол, и еще два дополнительных маркера, обладающих хорошей информативностью. С помощью этого набора в одной пробирке возможно протестировать образец сразу по 16 маркерам, что позволяет значительно интенсифицировать исследование. Существует еще ряд наборов для типирования, выпускаемых различными фирмами и используемых различными лабораториями, однако отличие их от CODIS препятствует как возможности создания единой базы данных по результатам типирования, так и свободному обмену данными между разными странами, что бывает актуально в ряде случаев.
Наиболее часто генетическую (или генотипоскопическую, или геномную дактилоскопию) экспертизу в гражданских делах назначают для установления отцовства или другого биологического родства. Как правило, перед экспертами ставят следующие вопросы: исключается или не исключается отцовство (материнство) данного индивидуума в отношении данного ребенка (плода); если отцовство (материнство) не исключается, то какова вероятность того, что полученный результат не является следствием случайного совпадения индивидуализирующих признаков неродственных лиц? Типирование (определение аллельного ряда по нескольким маркерам) каждого индивидуума и анализ соотношения выявленных аллелей между фигурантами дела позволяют ответить на эти вопросы.
В клетке зародыша образуются 23 пары хромосом, которые будут передаваться во все клетки будущего организма практически без изменений, и, таким образом, ребенок может иметь только тот генетический материал, который есть у его биологических родителей. Обнаружение у ребенка признаков (аллелей), которых невозможно обнаружить у предполагаемого отца, однозначно, с абсолютной точностью, говорит о том, что это неродной отец. Единственной тонкостью при таком исключении является количество несовпадающих локусов. Несмотря на достаточно низкую частоту мутирования, такие случаи описаны, и соответственно несовпадение отцовского (выявленного у предполагаемого отца) и нематеринского (выявленного у ребенка и отличного от того, который получен им от матери) аллеля ребенка по одному локусу не может быть однозначно определено как критерий исключения отцовства.
По международным требованиям, принятым на Втором международном симпозиуме по идентификации человека в 1991 году, для исключения отцовства необходимо несовпадение как минимум по трем локусам. Согласно Инструкции о проведении экспертного исследования по поводу спорного происхождения детей, утвержденной Министерством здравоохранения РФ N 161 от 24.04.2003, достаточно "как минимум двух несцепленных локусов", однако ложноотрицательность этого утверждения была зарегистрирована на практике.
Если у ребенка не обнаруживается аллелей, отличных от тех, которые есть у матери и предполагаемого отца, то всегда существует некоторая вероятность того, что данное совпадение признаков случайно. Не вдаваясь в математические формулы, по которым проводится расчет вероятности случайного совпадения совокупности генетических признаков (Р), отметим, что эта величина показывает принципиальную возможность гипотетического существования индивидуума, характеризующегося аналогичным сочетанием аллелей, и определяется исходя из статистических данных о частоте встречаемости аллелей каждого из маркеров в популяции. Частоты некоторых аллелей значительно варьируют в зависимости от расовой принадлежности обследованной выборки, а также могут иметь некоторые популяционные особенности, поэтому для расчета вероятности необходимо использовать частоты той этнической группы, к которой принадлежат обследуемые. Однако вычисление вероятности (P) не дает ответа на главный вопрос, призванный количественно охарактеризовать доказательственное значение экспертизы: если совпадение признаков установлено, то какова вероятность, что это совпадение закономерно, а не произошло по воле случайности?
Для ответа на этот вопрос используют вычисленную с использованием теоремы Байеса величину, называемую вероятностью отцовства (англ. - Probability of Paternity, РР). Вероятность отцовства рассчитывается по формуле:
РР = 1/(1 + Р),
где Р - частота встречаемости совокупности генетических признаков в популяции. Как правило, эту вероятность выражают в процентах: РР Х 100 = %. Международным сообществом принято считать, что для установления отцовства необходимо значение РР не ниже, чем 99,99%; согласно все той же инструкции Минздрава, уровень доказательности для экспертизы в России установлен как 99,9% для полного трио (мать - ребенок - предполагаемый отец).
Казалось бы, что 99,9% - величина значительная, однако реально это означает, что в каждой тысячной экспертизе возможна ошибка, тогда как международные правила допускают возможность ошибки лишь в каждом десятитысячном случае. При отсутствии одного из родителей доказательным для установления отцовства (материнства) считается значение 99,75%. Более низкое значение в случае дуэта обусловлено невозможностью в ряде случаев однозначно определить, какой же аллель ребенок получил от предполагаемого родителя, так как второй родитель неизвестен. Однако использование большего числа маркеров (локусов) позволяет достичь большего уровня доказательности, сравнимого с уровнем доказательности для трио. Бывают ситуации, когда необходимо установить родство в отношении человека, которого уже нет в живых. Генетическая экспертиза может решить и эту задачу, причем несколькими способами. Наиболее простым является анализ ДНК умершего, полученной из биологического материала патолого-анатомического образца. Такими образцами могут быть как парафиновые блоки с фрагментами органов и тканей, изъятые для гистологического исследования, так и сами гистологические образцы, а также хранящиеся в формалине органы. В случае отсутствия патолого-анатомического материала возможно установление отцовства косвенным путем, т.е. проведение анализа без исследования ДНК предполагаемого отца, а использование ДНК бабушки и дедушки. Поскольку предполагаемый отец не мог получить никакой другой генетический материал, кроме того, который есть у его родителей, т.е. бабушки и дедушки ребенка, то у ребенка не должно быть других аллелей, кроме тех, один из которых совпадает с одним из аллелей его матери, а другой присутствует хотя бы у кого-то одного - либо у бабушки, либо у дедушки. В случае, когда противоречий не наблюдается, также рассчитывается вероятность случайного совпадения комплекса признаков (Р), показывающая принципиальную возможность гипотетического существования для данного ребенка пары индивидуумов в качестве бабушки и дедушки, характеризующейся аналогичным сочетанием аллелей.
Существуют и другие ситуации, которые требуют установления родства, например, между братьями или между сестрами при отсутствии родителей. Часто такие вопросы возникают у уже взрослых людей. В случае однополых сибсов (детей одних родителей) возможно установление родства по материнской или отцовской линии. По материнской линии, т.е. от матери ко всем ее детям, но только от ее дочерей к внукам передается митохондриальная ДНК, что позволяет прослеживать женскую линию в поколениях. В митохондриальной ДНК выделяют два гипервариабельных региона (HVR), в которых существует множество точковых полиморфизмов. Совокупность различных нуклеотидов в той или иной позиции дает определенный митотип, который наследуется от матери к ребенку. Вследствие того, что различные варианты нуклеотидных замен расположены в небольшом по протяженности фрагменте митохондриальной ДНК, определение митотипов проводится путем прямого секвенирования. Установление тождества митотипов позволяет с вероятностью 93 - 98% утверждать, что данные индивиды принадлежат к одной матрилинейной группе, т.е. имеют общего предка по женской линии. Доказательность этого утверждения ниже, чем при типировании по маркерам ядерного генома, но иногда это единственная возможность установить родственные отношения. При этом надо учитывать, что один и тот же митотип будут иметь и родные сестры, и двоюродные, матерями которых являются родные сестры, и тетя с племянницей и т.д.
Генетическим материалом, передающимся только по мужской линии, является Y-хромосома, определяющая развитие организма по мужскому типу. На Y-хромосоме, так же как на всех аутосомах, существуют полиморфные тандемные повторы - STR-локусы, которые тоже могут быть использованы для типирования. Наиболее информативными STR-маркерами Y-хромосомы считаются следующие: DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385I/II, объединенные в так называемый минимальный гаплотип. Показано, что по результатам гаплотипирования по этому набору маркеров возможно отличить друг от друга представителей различных популяций с вероятностью более 99%. Для массового скрининга на анализаторах нового поколения с использованием флуоресцентной метки фирмой Promega разработана система из 6 тетрануклеотидных повторов Y-PlexTM6, в которую входят маркеры DYS393, DYS19, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS385, позволяющие исследовать 7 локусов в одной пробирке. По результатам типирования строится гаплотип Y-хромосомы, который заносится в базу данных, доступную через Интернет. Например, база данных www.ystr.org содержит на сегодняшний день информацию о 12802 минимальных гаплотипах, полученных при исследовании образцов ДНК из 83 Европейских популяций. Тождество гаплотипов Y-хромосомы свидетельствует о том, что эти индивиды имели общего предка по отцовской линии, причем этот же гаплотип будут иметь и родные братья, и двоюродные, если их отцы родные братья, и дед с внуком, дядя с племянником, и т.д.
Помимо установления родства генетическая экспертиза широко используется в уголовных делах. Типирование по Y-хромосоме особенно актуально при анализе образцов, полученных при расследовании изнасилований, так как позволяет анализировать только биологический материал, полученный от лиц мужского пола. Анализ смешанных образцов следов, оставленных на месте преступления, помимо технических особенностей типирования еще представляет собой и сложную математическую задачу. Выявление в следах образцов ДНК от большого числа лиц не позволяет получать доказательных результатов в отношении фигурантов дела.