Репликация. Особенности репликации хромосом эукариот

ПОЛУКОНСЕРВАТИВНАЯ РЕПЛИКАЦИЯ ДНК И ХРОМОСОМ

Структура ДНК и правило комплементарного спаривания оснований дают предста­вление о возможных механизмах удвоения (репликации) ДНК. Теоретически таких механизмов три.

Цепи отделяются друг от друга, и каждая служит матрицей для построения комплементарной цепи. В результате синтезируются две молекулы, у каждой из ко­торых одна цепь старая и одна новая. Такой способ репликации ДНК называют полу консервативным (рис. 9.1, а).

Если после удвоения одна молекула оказывается состоящей из двух старых це­пей, а другая — из двух новых, говорят о консервативном механизме репликации (рис. 9,1,6).

При дисперсном механизме репликации каждая из двух вновь образованных молекул должна содержать в обеих цепях как новые, так и старые участки (рис. 9.1, в). Чтобы узнать, какой из механизмов реализуется в клетках, надо уметь различать старые и новые цепи ДНК. Эту проблему смогли разрешить американские исследователи М. Мезельсон и Ф. Сталь в экспериментах по репликации ДНК ки­шечной палочки. Бактерии в течение большого числа поколений выращивали на среде, содержащей тяжелый изотоп азота ¹⁵N. У таких бактерий весь азот в ДНК за­мещался этим изотопом, и, следовательно, ДНК имела большую плотность, чем ДНК бактерий, выращенных на нормальной среде. Плотность молекул ДНК можно определить, центрифугируя ее в растворе хлористого цезия с очень высокой скоро­стью в течение нескольких дней. Под действием силы тяжести молекулы движутся и занимают в пробирке место, в котором их плотность равна плотности раствора. Пос­ле переноса бактерий на среду с нормальным (легким) изотопом ^l4N через опреде­ленные промежутки времени отбирали образцы культуры, выделяли ДНК и опреде­ляли ее плотность. В этих клетках синтезируется новая ДНК, в которую включаются легкие атомы азота. Если новая двойная спираль содержит одну родительскую и од­ну дочернюю цепи, то спустя одно поколение после переноса будет обнаружена ДН К с промежуточной плотностью; после двух циклов — ДНК с промежуточной плотно­стью и легкая ДНК. Если репликация консервативна, то старая молекула будет иметь две тяжелые цепи, а новая — две легкие, и после одного, и после двух циклов репли­кации в нормальной среде будет обнаруживаться как тяжелая, так и легкая ДНК. При дисперсном типе репликации должна появляться ДНК с промежуточной плотностью, но обе цепи молекулы должны содержать и тяжелый, и легкий изотопы. Ре­зультаты, полученные М. Мезельсоном и Ф. Сталем, представлены на рис. 9.2. После одного цикла в нормальной среде обнаружена только ДНК с промежуточной плотно­стью, после двух — половина ДНК имела промежуточную плотность, половина была легкой. При разделении цепей ДНК промежуточной плотности и центрифугировании одноцепочечной ДНК обнаруживаются тяжелые и легкие цепи. Эти результаты свиде­тельствуют о полуконсервативном типе репликации ДНК у кишечной палочки. Позд­нее подобные эксперименты проводили с другими прокариотическими и эукариотиче­скими организмами, и всегда оказывалось, что репликация ДНК полуконсервативна.

Удвоение хромосом в ядрах эукариот также происходит полуконсервативным способом. Это было доказано Дж. Тейлором в опытах на митотических клетках ко­решка бобов Viciafaba. Семена проращивали на среде, содержащей меченый ³Н-ти- мидин. Радиоактивная метка включается в ДНК; ее можно обнаружить в хромосомах

делящихся клеток. Если перенести корешки в среду без метки, во вновь синтезиро­ванные цепи ДНК будет включаться немеченый тимидин. После одного деления клеток в нормальной среде метку обнаруживали в обеих хроматидах метафазных хро­мосом, после второго деления — одна хроматида содержала метку, другая не содержа­ла метки (рис. 9.3). Эти результаты согласуются с представлением о том, что хрома­тида состоит из одной молекулы ДНК, и ДНК реплицируется полуконсервативно (рис. 9.4). Позднее Дж. Тэйлор показал, что перед мейотическим делением происхо­дит также полуконсервативная репликация ДНК.

Таким образом, репликация ДН К у про- и эукариотических организмов происхо­дит по полуконсервативному механизму. Каждая из двух цепей молекулы служит ма­трицей для создания комплементарной цепи, и каждая новая молекула состоит из одной родительской и одной дочерней цепи.

ТИПЫ РЕПЛИКАЦИИ ГЕНОМОВ

Репликация начинается с того, что в определенной точке происходит разъедине­ние двойной спирали и образование одноцепочечных участков ДНК, которые служат матрицей для синтеза новой цепи. Участок, в котором в данный момент времени происходит синтез ДНК, называют вилкой репликации. Описано три ти­па репликации геномов.

Репликация бактериальных и вирусных кольцевых геномов начинается с опре­деленной точки и идет в противоположных направлениях, т.е. у бактерий и вирусов существует одна точка начала репликации (оп) и две репликационные вилки. Репли­цирующаяся хромосома напоминает по структуре греческую букву 0. По завершении репликации 0-типа образуются две кольцевые молекулы (рис. 9.5).

У некоторых вирусов (например, у бактериофага X) и при амплификации ДНК генов рРНК в оогенезе у амфибий в одной цепи их кольцевой хромосомы происхо­дит разрыв фосфодиэфирной связи. Затем к свободному З'-концу разорванной цепи начинают присоединяться нуклеотиды, эта цепь растет, а кольцевая цепь служит ма­трицей. По мере роста разорванной цепи ее 5'-конец постепенно смещается, и начи­нается построение цепочки, комплементарной этому участку. Образующаяся структура похожа на греческую букву а (сигма). Такой тип репликации назы­вают «катящимся кольцом» или о-ти- пом. Вновь синтезированный «хвост» в определенных точках разрезается, и по завершении одного цикла реплика­ции образуется одна кольцевая молеку­ла и одна линейная. Длина образующе­гося «хвоста» иногда может в несколько раз превышать длину окружности кольцевой молекулы

Линейные хромосомы (у некото­рых вирусов и эукариот) начинают реп­лицироваться в одной или нескольких

точках, две вилки репликации движутся в противоположных направлениях. По заверше­нии репликации образуются две линейные молекулы (рис. 9.7).

Участок генома в пределах которого репликация начинается и заканчивается, на­зывается репликоном. Геномы прокариот удваиваются целиком, водном цикле реп­ликации, следовательно, их геномы представляют собой один репликон. В геномах эукариот точек начала репликации множество (несколько сотен или ты­сяч). Репликация ДНК начинается одновременно во многих точках, следовательно, геном представлен множеством репликонов.

Как в любом матричном процессе, в репликации можно выделить три этапа: ини­циацию, элонгацию и терминацию.

ИНИЦИАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ

Инициация репликации включает формирование репликационной вилки и син­тез РНК-праймера. В этом процессе участвует большое число белков и ферментов. Инициирующие белки должны выполнить, по крайней мере, три основные функции: 1) облегчить раскручивание молекул Д Н К и ее локальную денатурацию в области начала репликации; 2) обеспечить связь белков и ферментов, участву­ющих в репликации, с точками начала репликации; 3) обеспечить координацию клеточного цикла и процессов репликации. Для инициации репликации у эука­риот, в отличие от прокариот, связывания инициирующих белков с точками на­чала репликации недостаточно. Достижение компетентности в данном случае — сложный многоэтапный процесс.

Инициация репликации происходит в строго определенных участках. Выделены и определены последовательности нуклеотидов в точках начала репликации у ки­шечной палочки Е. coli, многих фагов и плазмид, у дрожжей, млекопитающих и не­которых вирусов эукариот.

У Е. coli этот сайт (oriQ представляет собой участок ДН К размером 245 нуклеоти­дов, состоящий из серии 9- и 13- нуклеотидных повторов. Область oriC у бактерий очень консервативна, хотя есть виды, у которых она не обнаружена. Процесс иници­ации начинается с присоединения к хромосоме белка DnaA. Это приводит к разделе­нию цепей и способствует работе основного расплетающего белка - геликазы (DnaB). В решении топологических проблем, связанных с разделением цепей двой­ной спирали, участвует и фермент гираза. С образовавшейся одноцепочечной ДНК связываются белки SSB (от англ. single strand binding), которые стабилизируют вилку репликации. Фермент праймаза синтезирует РНК-праймеры на лидирующей и от­стающей цепях.

Размер и структура элементов, обеспечивающих начало репликации у эукариот и прокариот, различны. Общим для всех сайтов начала репликации является их обога- щенность АТ-парами. По-видимому, это необходимо для обеспечения локальной де­натурации, поскольку АТ-пары образуют только две водородные связи.

События, происходящие при инициации репликации у эукариот и связи ее с кле­точным циклом, лучше всего изучены у дрожжей. Рассмотрим инициацию реплика­ции и клеточный цикл у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (рис. 9.8). На стадии G1, когда активность циклин-зависимой киназы Cdkl низка, формируется пре-реплика- ционный комплекс, в состав которого входят шесть белков комплекса ORC (ORC1-

и белки Cdc6 и Mem. Высоко консервативные белки, составляющие комплекс ORC специфически связываются сточками начала репликации и служат основой для присоединения других инициирующих белков Cdc6 и Mem. При переходе от стадии G1 к стадии S активность Cdkl возрастает и Cdc6p покидает комплекс. На его место «встает> белок Cdc45. В этой перестройке комплекса, необходимой для активации точки начала репликации в течение стадии S, принимает участие белок Cdc7-Dbf4- киназа. После инициации репликации пре-репликационный комплекс превращает­ся в пост-репликационный, он состоит только из белков ORC, связанных с хромати­ном. Этот комплекс сохраняется до конца митоза, когда активность Cdk 1 падает. Об­разование нового пре-репликационного комплекса становится возможным только в следующей стадии G1. Таким образом, в течение одного клеточного цикла происхо­дит лишь один цикл репликации. Белки ORC остаются связанными с точкой начала репликации, другие компоненты пре-репликационного комплекса или покидают его, или становятся частью вилки репликации. Например, белки Mcm2p-Mcm7p, по-видимому, функционируют как репликативная геликаза. У всех изученных эука­риот схема событий и белки, участвующие в инициации, сходны. Однако есть и не­которые отличия. Так, у некоторых организмов (другой вид дрожжей, дрозофила, ксенопус) для присоединения Mcm2p-Mcm7p к хроматину необходим дополнитель­ный белок Git 1. У дрожжей белки ORC остаются связанными с хроматином на всех ста­диях клеточного цикла, а у позвоночных во время митоза они отделяются от хроматина и вновь соединяются с ним только в стации G1. До сих пор не ясно, как репликационная машина (а-ДНК-полимераза-праймаза и репликационный белок А) связывается с точ­кой начала репликации, как части инициирующего комплекса (Mcm2p-Mcm7p и Cdc45p) преобразуются в компоненты вилки репликации. Гены, кодирующие основные белки, участвующие в инициации репликации ДН К у человека, приведены в табл. 9.2.

Разделение двойной спирали происходит с помощью ДНК-геликазы и реплика- ционного белка RPA (от англ. — replication protein Л). Репликационный белок А, со­стоящий из трех полипептидов, связывается с одноцепочечный ДНК, таким обра­зом он выполняет ту же функцию, что и SSB-белки у кишечной палочки. Затем а- ДНК-полимераза-праймаза синтезирует короткие (длиной примерно 30 п.н.) РНК- праймеры на лидирующей и отстающей цепях. После этого происходит замена а- полимеразного комплекса на комплекс 5-ДНК-полимеразы - основного фермента репликации ДНК у эукариот.

ЭЛОНГАЦИЯ ЦЕПЕЙ ДНК

Синтез новых цепей ДНК осуществляется группой ферментов с общим названи­ем ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы многих организмов выделены и хорошо охарактеризованы. Все полимеразы способны образовывать ковалентную связь между З'-концом цепи и 5'-концом свободного нуклеотидтрифосфата. Следова­тельно, новая цепь растет в направлении от 5'-конца к З'-концу вдоль матричной цепи, имеющей противоположное направление 3' -» 5' (рис. 9.9). Реакцию при­соединения нуклеотида эти ферменты осуществляют только в присутствии одно­цепочечной матрицы и короткого двухцепочечного участка со свободным З'- концом - праймера. Первый дезоксирибонуклеотид присоединяется к З'-концу РНК-праймера. Затем ДНК-полимераза один за другим присоединяет нуклеоти­ды, строя, таким образом, цепочку ДНК. Поскольку все полимеразы способны строить цепь только в одном направлении, на 3'—5' родительской цепи синтез новой цепи будет идти непрерывно, эту цепь принято называть лидирующей. Ли­дирующая цепь растет в направлении движения вилки, для ее элонгации необхо­дим лишь один акт инициации. На другой цепи синтез осуществляется коротки­ми фрагментами, которые называют фрагментами Оказаки по имени исследова­теля, впервые их обнаружившего (рис. 9.9). Эта цепь называется запаздывающей, или отстающей. Длина фрагментов Оказаки составляет 1 000-2 ООО п.н. у прокари­от и 100—200 п.н. у эукариот. Отстающая цепь растет в направлении противополож­ном движению вилки, при ее синтезе необходимо множество актов инициации.

Фрагменты Оказаки объединяются в непрерывную цепь ДНК после удаления РНК-праймеров и застраивания освободившихся участков дезоксирибонуклеотида-ми. Реакцию сшивания фрагментов осу­ществляют ферменты ДНК-лигазы, кото­рые катализируют образование ковалент­ной связи между З'-ОН одного фрагмента и 5'-фосфатом следующего.

Общая схема процессов, происходя­щих при элонгации цепей, одинакова у про- и эукариот.

У кишечной палочки в репликации ДНК участвуют два фермента: ДНК-поли- мераза I и ДНК-полимераза III. Ключе­вым ферментом репликации является ДНК-полимераза III. Полный комплекс ДНК-полимеразы III, способный осуще­ствлять реакцию полимеризации, включа­ет, по крайней мере, 20 разных белков, но каталитическую функцию выполняют 3 субъединицы — а (альфа), обладающая по­лимеразной активностью, е (эпсилон), об­ладающая 3' -> 5'экзонуклеазной активно­стью, и 0 (тета), функция которой пока неясна. Функции других субъединиц тоже неизвестны. Одна из них — (3 - уменьшает вероятность отделения фермента от мат­рицы до завершения процесса копирова­ния. В каждой вилке репликации находит­ся две молекулы холофермента, а в клетке -10-20 молекул. Он синтезирует ДН К ли­дирующей и отстающей цепей.

Д Н К-полимераза I участвует в синтезе отстающей цепи. Этот фермент состоит из одной полипептидной цепи и имеет 3 ферментативные активности. Благодаря 5' —> З'-экзонуклеазной активности он удаляет РНК-праймер, отщепляя рибонуклеотиды с 5'-концов фрагментов Оказаки. Его полимеразная активность обеспечивает нара­щивание цепи ДНК предыдущего фрагмента. 3' —> 5'-экзонуклеазная активность по­зволяет контролировать правильность присоединения каждого нуклеотида и удалять ошибочно вставленные неспаренные нуклеотиды с растущего конца цепи.

В репликативном синтезе ядерной ДНК эукариот участвуют два фермента: б- и е- ДНК-полимеразы. Наращивание лидирующей и отстающей цепей обеспечивает сложный белковый комплекс, в составе которого самое важное значение имеет 5-ДН К-полимераза, репликационный фактор RFC (от англ. replication factor Q и бе­лок PCN А (от англ. proliferating celt nuclear antigen). Репликационный фактор RFC со­стоит из пяти субъединиц различной молекулярной массы (140/145,40, 38, 37 и 36.5 кДа). Этот белок связывается с З'-концом только что синтезированного праймера и блокирует его наращивание, выполняемое а-ДНК-полимеразой) при длине пример­но 30 нуклеотидов. На этой стадии RFC способствует связыванию ДНК с белком PCNA, который, по-видимому, играет роль связующего звена между полимеразами идругими белковыми факторами комплекса. В результате этих процессов а-ДНК-по- лимераза вытесняется с З'-конца растущей цепи. Дальнейший синтез продолжается другими ферментами - 5- и в-полимеразами. 5-ДНК-полимераза человека - муль- тимерный белок, состоящий из четырех субъединиц 125, 50, 68 и 12 кДа. Тройной комплекс RFC-PCNA-5-ДНК-полимсраза обеспечивает элонгацию обеих цепей ДНК (рис. 9.10). Кроме репликации 5-ДНК полимераза участвует и в репаративных синтезах ДНК.

Удаление праймеров и сшивание фрагментов Оказаки происходит с участием 5- ДНК-полимеразы, РНКазы Н, ДНК-лигазы и флэп-эндонуклеазы. РНКаза Н ката­лизирует расщепление РНК в гибридных РНК-ДНК-молекулах, флэп-эндонуклеа- за отщепляет так называемые «свисающие 5'- концы», которые образуются в резуль­тате того, что 5-ДНК-полимераза обеспечивает синтез с вытеснением цепи.

Синтез митохондриальной ДНК осуществляету-ДНК-полимераза. Но механизм репликации ДНК в митохондриях несколько отличается от репликации хромосом­ной ДНК прокариот и эукариот. Наиболее важная особенность репликации мито­хондриальной ДНК - наличие сайтов инициации, специфичных для каждой из комплементарных цепей ДНК. Ген POLG, кодирующий у-ДНК-полимеразу у чело­века, локализован в 15q25. Праймер синтезируется митохондриальной ДНК-зависи- мой РНК-полимеразой, отвечающей как за экспрессию митохондриальных генов, так и за создание РНК-праймера для инициации репликации митохондриального генома. У человека этот белок кодирует ген POLRMT, локализованный в 19р13.3. Продукт этого гена больше похож на РНК-полимеразы фагов и митохондриальные полимеразы низших эукариот.

Другие многочисленные ДН К-полимеразы эукариот обеспечивают синтез ДН К, необходимый для репарации повреждений ДН К и рекомбинации.

ТЕРМИНАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ

У кишечной палочки существует участок, который обеспечивает терминацию репли­кации ДНК. В этом участке содержится несколько коротких последовательностей, гак называемых fer-сайтов (длиной =23 п.п.). Прекращение движения репликацион- ной вилки обеспечивается связыванием продукта лена tus с сайтами терминации.

Точки терминации - не обязательный элемент репликона. При двунаправленной репликации синтез ДНК прекращается, когда встречаются репликационные вилки. У эукариот синтез прекращается, когда встречаются вилки соседних репликонов.

СКОРОСТЬ РЕПЛИКАЦИИ

Скорость роста новой цепи практически постоянна. У Е. coli скорость копирования составляет примерно 1 500 нуклеотидов в секунду. Скорость движения репликацион- ной вилки в эукариотических клетках много ниже — 10—100 п.н. в секунду.

Скорость репликации генома определяется в основном частотой инициации реп­ликации. Высокая скорость репликации генома у эукариот обеспечивается одновре­менной инициацией множества точек начала репликации. Например, в клетках ран­них эмбрионов дрозофилы репликация всего генома происходит каждые 3 мин, точ­ки начала репликации отстоят друг от друга на 7 000-8 000 п.н. В культуре клеток дрозофилы скорость репликации генома значительно ниже, инициируется меньше то­чек начала репликации, они располагаются на расстоянии 40 000 п.н. друг от друга.

ТОЧНОСТЬ РЕПЛИКАЦИИ

Точность копирования ДНК чрезвычайно высока. Ошибочное включение осно­вания происходит с частотой Ю~⁸-Ю^-10. Однако известно, что физико-химиче- ские свойства оснований при образовании водородных связей должны давать бо­лее высокую частоту ошибок - до 10^-2. Высокая точность копирования достига­ется благодаря контрольным и корректорским функциям ДНК-полимераз, уча­ствующих в репликативном синтезе ДНК.

РЕПЛИКАЦИЯ ТЕЛОМЕР

При репликации линейных молекул ДНК возникает проблема репликации кон­цов. Поскольку все Д Н К-полимеразы осуществляют синтез только с использова­нием РНК-праймеров, и праймеры впоследствии удаляются, то 5'-конец цепи должен укорачиваться на длину праймера, т.е. на 10-30 нуклеотидов. Последовательное исчезновение концевых участков неизбежно должно приводить к потере генов. Теломеры — концевые участки хромосом, которые не несут генетической информации, а служат для защиты материала хромосомы от потерь при реплика­ции и от атак эндонуклеаз. Е. Блакберн и Дж. Голл выделили теломерную ДНК и расшифровали ее структуру. Теломеры у всех изученных организмов имеют сход­ное строение: они состоят из многократно повторяющихся фрагментов, напри­мер у человека это — TTAGGG. Во время деления нормальной соматической клетки теломеры теряют от 5 до двадцати фрагментов и с каждым делением ста­новятся короче. Укорочение до определенной критической длины становится сигналом к прекращению делений. Показано, что у соматических клеток есть ли­мит на число клеточных делений. При культивировании клеток, взятых у ново­рожденных детей, они могут пройти 80-90 делений, клетки 70-летних делятся только 20—30 раз. Ограничение на число клеточных делений называют порогом Хейфлика. Обычно клетки не преодолевают барьер из 20-90 делений. В раковых клетках ижклетках зародышевого пути, где число делений не ограничено, обна­ружен фертК! гг теломераза, который перед каждым циклом репликации добавля­ет TTAGGG-повторы к теломерам и таким образом компенсирует укорочение, вызванное работой ДНК-полимеразы. Теломераза присоединяет повтор после­довательно нуклеотид за нуклеотидом к З'-концу, при этом родительская Д Н К не используется в качестве матрицы. Теломераза — это рибонуклеопротеиновый комплекс, РНК которого содержит последовательность нуклеотидов, выступаю­щую в роли матрицы для синтеза TTAGGG-повтора.

Транскрипция ДНК у эукариот: этапы, ферменты, генетический контроль. Альтернативный сплайсинг.

Транскрипция - передача генетической информации с ДНК на РНК —достаточно подробно описана в различных учебниках биохимии. Остановимся только на ос­новных особенностях этого процесса, осуществляемого с помощью ферментов и белковых факторов.

Ферменты и белковые факторы транскрипции. Ключевой фермент транскрипции - PH К-полимераза. У прокариот она состоит из пяти субъединиц, одна из которых (о-субъединица) предназначена для инициации транскрипции, а другие - для ее элонгации. У эукариот обнаружено три РНК-полимеразы, их локализация в клетке и функции различны. РНК-полимераза 1 выявляется в ядрышке и ответственна за транскрипцию рРНК, РНК-полимераза II находится в нуклеоплазме и обеспечивает 20—40% клеточной активности. Она ответственна за синтез гетерогенной ядерной РНК (гяРНК) — предшественника мРНК. РНК-полимераза III локализована в нук­леоплазме и осуществляет синтез малых ядерных PH К, тРН К и 5S PH К. Однако мно­гие малые РНК транскрибируются РНК-полимеразой II. За раскручивание ДНК на участке, подлежащим транскрибированию, а также спирализацию ДНК после окон­чания синтеза РНК и отсоединение транскрипта от ДНК отвечают ДНК-топоизоме- разы. В процессе аутосплайсинга задействованы рибозимы РНК с ферментоподоб­ной активностью.

У бактерий РНК-полимераза связывается непосредственное промотором, а у эукари­от для этогонеобходимо присутствие дополнительных белков. Белки, которые помогают РНК-псшимеразе узнать промотор, называют факторами транскрипции (TF — от англ. transcription factor). В отличие от о-фактора они могут присоединяться к Д Н К независимо. Например, белок ТВР связывается с ТАТА-боксом промотора, NF-El-эритроид-специ- фический фактор; TF-II-факторы образуют базальный транскрипционный комплекс с РНК-полимеразой II,TF-III - с РНК-полимеразой III.

ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ

Транскрипция, как и другие процессы синтеза биополимеров, состоит из следующих этапов: инициации, элонгации и терминации. Инициация важнейший этап, во время которого осуществляется регуляция процесса транскрипции.

РНК-полимераза прокариот выбирает матричную цепь, находит промоторный участок (структура его описана ниже) и локально расплетает цепи ДНК. После обра­зования гибридного ДНК/РНК-олигонуклеотида одна из субъединиц, называемая сигмой, отделяется от РНК-полимеразы. Следующий этап - элонгация, как и все ма­тричные процессы, проходит в направлении 5'-> 3'. Синтезируемая вновь молекула РНК комплементарна матричной цепи. РНК-полимераза осуществляет элонгацию цепи РНК путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов из рибонуклеозид- трифосфатов: ATP, GTP, UTP, СТР.

У бактерий частично синтезированная молекула РНК соединяется с рибосомами, и еще до окончания процесса транскрипции с 5'-конца начинается трансляция. На З'-конце находятся терминаторные последовательности ДНК, ответственные за пре­кращение транскрипции. У прокариот существует два типа терминации: р-зависимая, требующая участия р-факторов, и p-независимая. После окончания транскрипции, как у прокариот, так и у эукариот происходит цепь биохимических реакций, которая приводит к созреванию молекул предшественников: транспортной РНК (пре-тРНК) и рибосомной РНК (пре-рРНК) и пре-мРНК (только у эукариот). Совокупность ре­акций, приводящая к формированию зрелой (готовой к трансляции) молекулы мРНК, называется процессингом.

Особенности транскрипции у эукариот. Процессинг мРНК. Процессинг включает следующие преобразования молекулы мРНК: 1) метилирование и кэпирование; 2) полиаденилирование; 3) сплайсинг.

Эукариотические мРНК несут, как правило, на 5'-конце дополнительную груп­пу: КЭП-модифицированный в 7-положении метилированный остаток гуанозин- 5'-трифосфата, соединенный с концевым нуклеозидом 5'-5'-способом. Кэпирова­ние РНК осуществляется ферментами: гуанилтрансферазой и метилтрансферазой. Предполагают, что КЭП необходим для регуляции трансляции и для стабилизации мРНК, (он предохраняет ее от действия 5'-экзонуклеаз). К З'-концу РНК после за­вершения ее синтеза с помощью фермента поли(А)-полимеразы присоединяется последовательность полиадениловой кислоты. Этот процесс называют полиаденили- рованием. Остальные варианты преобразования пре-мРНК: вырезание интронов и сшивание экзонов (сплайсинг) в эукариотических генах, а также образование раз­личных сочетаний экзонов, входящих в зрелую м PH К (альтернативный сплайсинг) - описаны в гл. 3 и 4.

Эукариотические мРН К в отличие от прокариотических стабильны в течение ча­сов и суток. Это объясняется, во-первых, стабилизацией 5'- и З'-концов, а во-вто- рых, связыванием мРНК с белками (т.е. образованием информосом). Пре-мРНК на всех стадиях процессинга и после него связана с белками. Информосомы могут быть ядерными и цитоплазматическими. Ядерные информосомы — это рибонуклеопро- теиновые (РНП) частицы с константой седиментации 30S. Посттранскрипционный внутриядерный перенос пре-мРНК из ядра в цитоплазму осуществляется с помо­щью ядерных информосом. При этом переносе зрелой мРНК происходит замена связанных с мРН К белков. Ядерные информоферы (белковые глобулы) остаются в ядре, а мРНК после перехода в цитоплазму объединяется с новыми белками, обра­зуя цитоплазматические информосомы. Цитоплазматические информосомы не обязательно транслируются, т.е. могут быть свободными.

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

Промоторы. Регуляция экспрессии генов эукариот основана на тех же принципах, что и у прокариот, хотя существуют и различия. Во-первых, как уже упоминалось, у эукариот нет оперонов, и каждый ген представляет собой независимую транскрип­ционную единицу. Промоторы эукариот несколько отличаются от прокариотиче­ских по структуре. Функционально наиболее важные последовательности в промо­торе эукариотического гена находятся в положениях «-25» (бокс Хогнесса) и «-75». Есть и другие участки, более удаленные от стартовой точки транскрипции.

Другую структуру имеют промоторы генов транспортных, рибосомных РНК и 5SPHK. Прежде всего, эти промоторы внутренние, поэтому перед номерами их ну­клеотидов ставится знак «+». Промотор гена тРНК представлен на рис. 12.4. В про­моторе гена тРН К имеются А- и В-боксы. Установлены их канонические последова­тельности. При уменьшении расстояния между боксами транскрипция снижается или полностью прекращается. Замена всего одного нуклеотида в В-боксе в положе­нии 56 CG -» GC в T%G петле искажает правильную структуру тРН К. Регуляторная область гена 5S имеет сходную структуру. Она расположена между +50- и + 90-нук­леотидами и также имеет А- и С-боксы (рис. 12.5).

Энхансеры. Среди регуляторных элементов эукариот выделяют энхансеры, которые обычно располагаются достаточно далеко от регулируемого гена. Предполагается, что сближение энхансера и промотора достигается в результате образования между ними петли ДНК, при этом белки-активаторы, «узнающие» энхансер, могут непосредственно взаимодействовать с транскрипционным комплексом.

Энхансеры — усилители транскрипции — обладают следующими свойствами:

могут находиться как в 5', так и в З'-областях, а также в интронах и даже на значительном расстоянии от промоторов;

активируют гены независимо от ориентации;

один энхансер может активировать различные гены;

действие их может быть ткане- и видоспецифичным;

энхансеры доступны действию различных белков, в том числе и гормонов

Сайленсеры - ослабители транскрипции — являются негативными элементами по отношению к транскрипции. Они так же, как и энхансеры, функционируют в цис- положении и могут оказывать свое действие на большом расстоянии от гена и при разной ориентации по отношению к нему.

Транскрипционные факторы. Многоклеточные эукариоты состоят из различных типов клеток, разнообразие которых обусловлено дифференциальной экспрессией генов, определяющих образование тканеспецифических белков. Один из механиз­мов, лежащих в основе дифференциальной экспрессии, — регуляция процесса транскрипции.

Так, изучено влияние регуляторных белков на активность промотора альбумино­вого гена ALB млекопитающих, функционирующего в клетках печени. Левее старто­вой точки расположены: последовательность промотора ТАТА (определяющего на­чало транскрипции, но не частоту инициации этого процесса) и последовательность ССААТ (влияющая на эффективность транскрипции). Тканевая специфичность оп­ределяется взаимодействием специфических факторов транскрипции со вспомога­тельными последовательностями промотора РЕ, DEI, DEII, и DEIII (рис. 12.6). Пос­ледовательность РЕ у мыши (из 13 нуклеотидов) служит сайтом связывания для тка­неспецифического белка печени - HNFI. С последовательностью DE1 взаимодейству­ет белок СВР, ас DE11 - NF1. Эти белки не обладают специфичностью, их роль - акти­вация процесса транскрипции. Пока не ясно, каким образом взаимодействуют специ­фические и неспецифические белки в регуляторной области гена ALB.

Установлены сайты связывания регуляторных белков в промоторе гена (5-интер­ферона IFN. Промотор этого гена находится между парами оснований —204 и +1. Левее ТАТА-бокса расположены последовательности пяти элементов, две из кото­рых (NRDI и NRD2) ответственны за негативную регуляцию, а три (PRDI, PRD1I и PRD111) способствуют активации транскрипции при присоединении к ним соответ­ствующих белков. Механизм смены этих процессов пока не изучен.

Факторы транскрипции и ядерный матрикс. Ядерный матрикс был открыт в 50-е годы прошлого века И.Б. Збарским. Эта структура состоит из нерастворимых белков. Именно на нем происходит процесс транскрипции и созревания пре-мРНК. Пока­зано, что факторы транскрипции, соединяясь с ядерным матриксом, обеспечивают правильное пространственное расположение промоторных и энхансерных участков генов (рис 12.7). Они взаимодействуют с ДНК в участках связывания с матриксом и другими белками ядерного матрикса, которых выявлено не менее 50. К ним относят­ся белки, связывающиеся с ДНК посредством «цинковых пальцев» (SP-1, МуТ1, ZNF74, ATRX); белки, связывающиеся с ДНК с помощью «лейциновой застежки- молнии» (С/EBP, ATF, YY-1); рецепторы стероидных гормонов и ассоциированные с ними факторы; белки с HMG-доменом (HMG1, HMG2, HMG14, HMG17, AVL-1B, NMP2) и многие другие.

Часто транскрипционные регуляторные факторы имеют специфическую струк­туру, например, структуру типа «цинковых пальцев». Она характеризуется аминокис­лотными петлями, имеющими в основании два цистеина в одной части петли и два гистидина - в другой, связанные ионом цинка (рис. 12.8). Наряду с такими фермен­тами как PH К-полимеразы и топоизомеразы, в клетках эукариот присутствуют раз­личные регуляторные белки, взаимодействующие с промоторами, энхансерами и сайленсерами. Таким белком является Р1, взаимодействующий с CCGCCC-блоком и ядерный фактор, связывающийся с СААТ-блоком. Нуклеосомы в активном хрома­тине соединены с белками HMG14 и HMG17.

В научной литературе обсуждаются различные гипотезы, обьясняющие, как РНК-полимераза может транскрибировать хроматин. В соответствии с одной из них, нуклеосома разворачивается, половинки ее сердцевины разъединяются, РНК-поли­мераза транскрибирует ДН К, а затем половинки нуклеосомы опять складываются. Согласно другой модели, РНК-полимераза транскрибирует витки ДНК, которые ну­клеосома сбрасывает по очереди: сначала один виток, а затем — другой.

Метилирование оснований ДНК. Значительную роль в регуляции экспрессии ге­нов у эукариот может играть метилирование ДНК (обычно по 5-му углероду цитози­на). Неактивные гены содержат относительно много метальных групп. Состояние повышенного метилирования может стабильно поддерживаться в течение многих поколений клеток. Для этого существует специальный механизм,

обеспечивающий присоединение метальных групп в местах, аналогичных тем, где уже произошло ме­тилирование вдругой цепи. Механизм действия метальных групп заключается втом, »по они нарушают взаимодействия ДНК-белок. Выступая в большую бороздку ДНК, метальные группы препятствуют связыванию транскрипционных факторов. Кроме того, метилированные районы ДН К могут взаимодействовать с транскрипци­онными репрессорами типа МеСР2, являющегося составной частью белкового регу­ляторного комплекса.

Импринтинг. Феномен импринтинга демонстрирует роль метилирования в регу­ляции экспрессии генов. Суть этого феномена заключается в том, что аллели, унас­ледованные от отца и матери, экспрессируются по-разному. Согласно одной из ги­потез, это связано с различным метилированием аллелей при образовании половых клеток. Подробно болезни импринтинга рассмотрены в части II. Медицинская генетика.

Другой пример влияния метилирования на активность генов - лайонизация од­ной из Х-хромосом у женщин. Гены инактивированной (лайонизированной) хромо­сомы почти все метилированы.

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

Этот тип регуляции может проявиться на разных уровнях организации генетическо­го материала (генном, хромосомном, геномном).

Примером неспецифической регуляции на генном уровне может служить потеря активности любого гена, попавшего в гетерохроматин, при этом наблюдается так называемый «эффект положения генов». Так, у гетерозиготных самок w+/w проявля­ется аллель while из-за потери активности нормального аллеля вследствие переноса его в прицентромерный гетерохроматин с помощью инверсии (см. рис. 5.3).

Примером регуляции активности генов на хромосомном уровне является потеря активности генов в половом хроматине, т.е. в гетерохроматизированных половых хромосомах. Факультативная гетерохроматизация достигается в этих хромосомах за счет плотной упаковки хроматина. Вследствие такой конденсации гены, локализо­ванные в этих половых хромосомах, не транскрибируются.

В ходе развития может быть инактивирован и весь геном. У диплоидных самцов мучнистого червеца Planococcus cirti теряют активность все «отцовские» хромосомы, которые также, как и половые хромосомы у млекопитающих, способны к факульта­тивной гетерохроматизации. Самцы этого вида имеют эухроматиновый материн­ский набор хромосом и гетерохроматиновый гаплоидный набор, полученный от отца, в то время как у самок активны оба набора хромосом, поэтому самцы мучнистого чер­веца, несмотря на наличие диплоидного набора хромосом, функционально гаплоидны.

Гетерохроматизироваться могут все хромосомы диплоидного организма (напри­мер, в эритроцитах у кур).

Альтернативный сплайсинг — процесс, в ходе которого экзоны, вырезаемые из пре-мРНК, объединяются в различных комбинациях, что порождает различные формы зрелой мРНК. В результате один ген может порождать не одну, а множество форм белка. Для некоторых описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же транскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути. Поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК, и соответственно, разных белков одного первичного транскрипта. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Разные изоформы тропонина образуются в разных тканях и на определенных стадиях их развития.

Пре-мРНК некоторых генов эукариот могут подвергаться альтернативному сплайсингу. При этом интроны в составе пре-мРНК вырезаются в разных альтернативных комбинациях. Разные варианты альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК могут осуществляться в разные периоды развития организма или в разных тканях, а также у разных особей одного вида[1]. Как правило, при альтернативном сплайсинге из первичного транскрипта удаляются и некоторые экзоны.

Существует несколько механизмов альтернативного сплайсинга:

1. Экзон может вырезаться или оставаться в составе мРНК.

2. Один из двух «взаимоисключающих» экзонов вырезается, а другой остаётся.

3. Использование альтернативного донорных сайтов: используются разные 5'-точки разрезания первичного транскрипта (донорные сайты), что изменяет 3'-границу вышележащего (upstream) экзона

4. Использование альтернативных акцепторных сайтов: используются разные 3'-точки разрезания транскрипта (акцепторные сайты), так что меняется 5'-границы нижележащего (downstream) экзона.

5. Сохранение интронов в составе мРНК. В этом случае для сохранения функциональности белка интрон должен содержать последовательность нуклеотидов, не вызывающую сдвиг рамки считывания и не содержащую стоп-кодонов.

Существуют и другие механизмы альтернативного сплайсинга.

Некоторые из продуктов альтернативного сплайсинга пре-мРНК нефункциональны (такой вариант альтернативного сплайсинга осуществляется у дрозофилы при определении пола), но нередко в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК одного гена образуются многочисленные мРНК и их белковые продукты.[2]

Показано, что у человека 94 % генов подвержено альтернативному сплайсингу (у остальных 6 % генов нет интронов). Геном круглого червя Caenorhabditis elegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному сплайсингу подвергаются пре-мРНК только 15 % генов. Таким образом, альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие белковых продуктов генов, сохраняя при этом относительно небольшое количество различных генов в геноме и не создавая избыточных копий генов.