Генна інженерія і біосинтез білка

Генна інженерія відкриває нову еру в біології. Це пояснюється насамперед тим, що з'явилися нові можливості для проникнення в глибину біологічних явищ з метою повнішої характеристики форм існування живої матерії, ефективнішого вивчення структури і функцій генів на молекулярному рівні для розуміння тонких механізмів роботи генетичного апарата. Разом з цим генна інженерія забезпечує моделювання на молекулярному рівні мутацій і рекомбінацій — основних генетичних процесів, факторів еволюції.

Успішне проведення досліджень у галузі генної інженерії має крім теоретичного важливе практичне значення. Генна інженерія створює основи для пізнання способів та шляхів «конструювання» нових або направленої зміни існуючих організмів, сприяє позитивному розв'язуванню проблеми направленого біосинтезу важливих для організму сподук, зокрема білків. Суть цього процесу полягає в тому, що за допомогою певних методів (синтез на ІРНК. за участю ревертазн, звичайний хімічний синтез) добувають ген, який визначає синтез відповідного білка. Далі такий ген вбудовується у відповідну систему, яка дає йому можливість швидко розмножуватися. Такою системою, яку часто називають вектором, служать плазміди — автономні структури, що несуть свою інформацію у вигляді невеликої циклічної молекули ДНК. Вони виявлені в клітинах бактерій разом з бактеріальною хромосомою. Крім плазмід можна використовувати також інші системи — віруси, фаги і т. д.

Плазміди, що містять вбудований ген (рекомбінантні ДНК), вводять у клітини бактерій, які завдяки цьому набувають здатності синтезувати нові для них речовини. Це основний принцип генної інженерії, мета якої — добування білків людини, тварин і рослин, які особливо необхідні в практичній діяльності, наприклад у медицині. До таких важливих білків належить, наприклад, гормон інсулін. Нестача інсуліну в організмі людини призводить до тяжкого і досить поширеного захворювання — діабету. Для його лікування використовують інсулін тваринного походження, добутий з підшлункової залози великої рогатої худоби або свиней.

Однак останнім часом з'ясовано, що для частини людей він не ефективний або ж викликає сильну алергію. Це пояснюється тим, що інсулін людського і тваринного організмів характеризується певною структурною відмінністю. Отже, виникла потреба у виробництві інсуліну людини. Добувати його синтетично економічно невигідно.

Генна інженерія дала рентабельніший шлях синтезу інсуліну. Добуто штами бактерій з рекомбінантними ДНК, які виробляють про-інсулін людини, з якого далі вже легко добути інсулін (рис. 66).

Другим важливим здобутком генної інженерії є інтерферон — універсальний противірусний препарат. Основою його є білок, який виробляється клітинами організму для боротьби з вірусною інфекцією. Вивчення влстивостей інтерферону показало, що він виявл-/ є високу видову специфічність. Тому для лікування людей можна використовувати інтерферон лише людини.

Інтерферон добувають в основному із лейкоцитів донорської крові. Однак такий шлях добування інтерферону досить дорогий і, крім того, не здатний повністю забезпечити потребу в ньому. Тому інтенсивно ведуться роботи по розробці нових методів добування інтерферону, зокрема шляхом генної інженерії. В цьому плані програма добування штаму — продуцента інтерферону — успішно завершена, що дало змогу виробляти препарат у достатніх кількостях. Крім того, методом генної інженерії добуто ще один важливий білок — сома-тотропін. Це гормон росту людини, до складу якого входить 191 залишок амінокислот. Соматотропні застосовують для лікування карликовості, при переломах кісток, опіках та при інших захворюваннях.

Отже, генна інженерія відкриває нову технологію (біотехнологію) синтезу важливих для організмів людини і тварин речовин, зокрема білків. Це дає мжливість значно знизити вартість і розширити асортимент виробництва гормонів, ферментів та інших білкових препаратів, які використовуються в медицині та сільському господарстві.

РЕГУЛЯЦІЯ СИНТЕЗУ БІЛКА

Необхідною умовою існування живих систем, забезпечення їх життєдіяльності є наявність узгодженої системи регулювання найважливіших процесів, які протікають в них. Це, насамперед, стосується синтезу білка, оскільки оптимальне співвідношення між кількістю і якістю різних білків відіграє важливу роль у забезпеченні ряду жит-тєвоважливих процесів як для одноклітинних, так і для багатоклітинних організмів. За участю білків-ферментів здійснюється регуляція обміну речовин, адаптація організмів до зміни умов зовнішнього і внутрішнього середовищ, процеси онтогенезу та диференціації клітин, органів і систем. Тому досить важливим є здійснення контролю за синтезом саме тих білків-ферментів, які необхідні клітині за даних умов залежно від функцій, які вона повинна виконувати. В зв'язку з цим у процесі тривалого еволюційного розвитку живих організмів, незалежно від ступеня їх організації, сформувався досить складний, узгоджений механізм регуляції синтезу білка, який забезпечує сталі якісний та кількісний склад білків, необхідний для виконання певних фізіологічних функцій.

З'ясування суті механізму регуляції синтезу білка є досить складною проблемою, яка ще не повністю розв'язана. Над вирішенням цієї проблеми протягом кількох десятиріч працювала велика група різних дослідників-генетиків, біохіміків, молекулярних біологів. Логічним розвитком даних досліджень стала концепція регуляції синтезу білка, розроблена в 1961 р. лауреатами Нобелівської премії французькими вченими Ф. Жакобо і Ж- Моно. Грунтується вона на даних спостережень за індукцією і репресією утворення ферментів у клітинах бактерій Е. соїі.

Дослідженнями виявлено збільшення концентрації деяких ферментів бактерій при добавлянні в середовище субстратів, на які вони діють, і зниження концентрації ферментів при наявності кінцевих продуктів реакцій, що каталізуються даними ферментами. Отже, між цими процесами встановлено тісний взаємозв'язок.

Концепція Ф. Жакобо і Ж- Моно, сформульована в дослідах на прокаріотах, дістала широке визначення і вважається загальноприйнятою. Згідно з цією концепцією, регуляція синтезу білка здійснюється на рівні ДНК, молекула якої складається з певних функціональних ділянок — генів, згрупованих залежно від функцій, які вони виконують. Одна група таких функціональних ділянок названа структурними генами, або цистронами, вони містять інформацію про синтез певних поліпептидних ланцюгів білка, на них відбувається синтез молекул ІРНК, яка далі надходить до рибосом, де виконує роль матриці в процесі синтезу білка. Початок синтезу ІРНК — зчитування генетичної інформації — розпочинається з функціональної ділянки ДНК, яка має назву промотора і є точкою ініціації її синтезу.

Іншу групу функціональних ділянок ДНК становлять регуляторні гени, які регулюють активність структурних генів шляхом їх «включення» та «виключення». Регуляторні гени представлені геном-оператором, що знаходиться безпосередньо біля групи структурних генів, і геном-регулятором, що знаходиться від них на деякій відстані.

Геп-оператор є ніби пусковим механізмом, який, залежно від умов, дозволяє або гальмує синтез ІРНК на структурних генах ДНК- Вважають, що ген-оператор локалізований на крайньому відрізку цистро-нів і є, очевидно, вихідним пунктом дії ДНК-залежної РНК-полі-мерази.

Гени-оператори разом з групами структурних генів утворюють групи узгоджено діючих блоків — оперонів, кожен з яких відповідає за взаємозв'язаний синтез ряду специфічних білків, тобто оперон є одиницею транскрипції. Якщо ген-оператор не діє, то весь оперон стає бездіяльним — гальмується синтез ІРНК, а отже, і білків, ферментів. Діяльність гена-оператора регулюється геном-регулятором. Оскільки ген-регулятор і структурні гени оперона розташовані на різних ділянках ДНК, то зв'язок між ними забезпечують речовини-посередники —

І

білки-репресори, що утворюються в рибосомах на матриці специфічної мРНК. яка синтезується на гені-регуляторі.

Свою назву білок-репресор дістав завдяки тому, що його дія на ген-оператор гальмує (репресує) діяльність останнього, внаслідок чого припиняється функціонування всієї групи структурних генів. Білки-репресори виявляють спорідненість до гена-оператора і здатність до зворотного зв'язування з ним. Крім того, білок-репресор здатний до специфічного зв'язування з певними низькомолекулярними речовинами, так званими індукторами, або ефекторами.

За звичайних фізіологічних умов репресори можуть перебувати в активному або пасивному стані. Перехід з одного стану в інший регулюється продуктами внутрішньоклітинного обміну або речовинами, що надходять із зовнішнього середовища.

Залежно від стану білка-репресора розрізняють індуцибельну і ре-пресибельну системи генної регуляції синтезу білка.

При індуцибельній системі регуляції білок-репресор, що утворюється на гені-регуляторі, перебуває в активному стані. Його вплив на ген-оператор призводить до блокування діяльності оперона і припинення синтезу іРНК і певних білків-ферментів. Синтез їх може відновлюватися лише тоді, коли в клітині з'являються продукти, для утилізації яких необхідні дані ферменти. Білок-репресор, сполучаючись з цими продуктами (індукторами), втрачає здатність контролювати ген-оператор, внаслідок чого відновлюється синтез і РНК.

Вважають, що індуктор, сполучаючись з білком-репресором, зумовлює зміну його третинної структури, внаслідок чого останній втрачає здатність до зв'язування з субстратом — геном-регулятором. Разом з тим оператор, який виходить з-під контролю гена-регулятора, набуває активності і приводить у дію блок структурних генів, на яких здійснюється синтез ІРНК, необхідних для утворення певних ферментів. Оскільки дані ферменти спрямовані па утилізацію індуктора, білок-репресор буде пасивним доти, поки під впливом ферментів не відбудеться повне розщеплення індуктора. Після цього білок-репресор вивільнюється, переходить в активний стан і блокує оперон, внаслідок чого синтез іРНК, що кодує первинну структуру даних ферментів, припиняється. На рис. 67 зазначено основні етапи індуцибельної системи регуляції синтезу білка.

Прикладом індуцибельної регуляції синтезу білка може бути синтез у клітинах бактерій Е. соїі ферменту галактозидази, який зумовлює гідроліз молочного цукру (лактози) на глюкозу і галактозу. Штами бактерій, які ростуть на глюкозі, не здатні до розвитку, якщо їх помістити в середовище, що містить замість глюкози лактозу до того часу, поки не закінчиться синтез відповідних ферментів, здатних утилізувати даний субстрат і використовувати його як джерело енергії, тобто поки не здійсниться так званий адаптивний синтез необхідних ферментів.

13 5-287

___________ One/юн -____________

Структури* гени

Рис. 67. Схема регуляції синтезу білка шляхом індукції (за Т. Т. Березовим і Б. Ф. Коровкіним): ГР — ген-регулятор; П — промотор; ГО — геи-оператор

Лактоза, що потрапляє в середовище, виконує роль індуктора, який сполучається з білком-репресором і блокує його зв'язок з геном-оператором. Ген-оператор і структурні гени вивільнюються і починають синтез ІРНК, яка кодує первинну структуру ферменту галакто-зидази і забезпечує синтез даного ферменту на рибосомах. Оскільки синтез даного ферменту здійснюється під впливом речовини-індуктора, він має назву індукованого ферменту, а система, в якій проходить синтез, називається індуцибельною, оскільки має місце стимуляція (індукція) діяльності генів.

Крім індукції генів у клітинах відбувається їх репресія. Особливо часто цей процес спостерігається при процесах синтезу, коли концентрація багатьох ферментів значно знижується при збільшенні концентрації кінцевих продукців реакцій, що каталізуються даними ферментами. При репресибельній системі регуляції синтезу білка білок-репресор, що синтезується на рибосомах клітини, перебуває в пасивному стані іне може пригнічувати діяльність гена-опера-тора, а отже, і не контролює діяльність оперона, на якому проходить синтез іРНК. Активація білка-репресора, блокування оперона і припинення синтезу іРНК відбуваються під впливом корепресора, який утворює комплекс з опероном. Корепресорами є кінцеві продукти реакції синтезу, або один з цих продуктів. Є дані, що корепресором

Рис. 68. Схема регуляції синтезу білка шляхом репресії (за Т. Т. Березовим і Б. Ф. Коровкіним) (позначення ті самі, що й на рис. 67)

у процесі синтезу ферментів обміну амінокислот може бути не вільна амінокислота, як кінцевий продукт реакції біосинтезу, а її комплекс

з тРНК (аміноацилтРНК).

Блокування гена-оператора припиняється тоді, коли вичерпується весь корепресор. Внаслідок цього за відсутності активатора (корепре-сора) білок-репресор переходить у свій звичайний пасивний стан, вивільнює ген-оператор і групу структурних генів, на яких відновлюється синтез бідків-ферментів. На рис. 68 наведено схему репреси-бельної системи регуляції синтезу білка.

Як зазначалось раніше, концепція Ф. Жакобо і Ж. Моно відносно регуляції синтезу білка стосується нижчих організмів — прокаріот. Механізм регуляції цих процесів у клітинах високоорганізованих організмів — еукаріот — значно складніший. Певний внесок у розв'язання цієї проблеми зробив Г. П. Георгієв. Згідно з його гіпотезою, в клітинах вищих організмів гени також згруповані в оперони, однак їхній склад не такий простий, як у мікроорганізмів. Основна відмінність полягає в тому, що оперон має ряд генів-операторів і кожен з них реагує з іншим білком-репресором. Блокування будь-якого гена-оператора перешкоджає просуванню ферменту ДНК-залежної РНК-полімерази. Як результат цього синтез ІРНК на структурних генах сповільнюється або припиняється зовсім.

Із-за наявності кількох генів-операторів на активність оперона впливає кілька різних факторів. Наприклад, один ген-оператор може

13*

блокуватися з підвищенням концентрації певного гормона, інший — з нагромадженням у клітині певного продукту обміну і т. д. Крім цього, один і той самий ген-оператор входить до складу різних опе-ронів. Тому ці опероии реагують на один і той самий фактор. Це свідчить про те, що будь-який один фактор може регулювати відразу кілька оперонів, а активність одного оперона може залежати від кількох різних факторів. Це створює досить точну і разом з тим гнучку систему саморегуляції.

Стід зазначити, що ряд питань, які стосуються механізмів, що зумовлюють специфічність біосинтезу білків, а також регуляції синтезу білків, вивчено ще недостатньо. _Л

Запитання і вправи для самоконтролю

1. Які процеси відбуваються під час обміну білків?

2. У чому полягає значення білків їжі для живого організму?

3. Що таке повноцінні і неповноцінні білки?

4. Яка добова потреба людини в білках?

5. Що таке азотистий баланс організму? Які бувають види азотистого балансу?

6. Які ферменти беруть участь у розщепленні білків? Зазначте особливості їх дії.

7. У чому виявляється селективність дії протеолітичних ферментів?

8. Яка біологічна роль НС1 у процесі травлення?

9. Зазначте кінцеві продукти гідролізу білків у тонкій кишці.

10. Дайте характеристику механізмів всмоктування амінокислот.

11. Яким перетворенням піддаються амінокислоти в процесі внутрішньоклітинного обміну?

12. Перечисліть основні види перетворень амінокислот.

13. Які види перетворень за аміногрупою характерні для амінокислот?

14. Схарактеризуйте види дезамінування амінокислот.

15. Яке значення для організму мають процеси иереамінування амінокислот?

16. Напишіть схеми різних видів дезамінування.

17. Напишіть схему переамінування а-кетоглутарової кислоти та аланіну.

18. Які сполуки утворюються під час декарбоксилювання амінокислот?

19. Запишіть схеми декарбоксилювання гістидину, триптофану, аспарагінової та глутамінової кислот.

20. Запишіть рівняння реакцій утворення аміноациладенілатів за карбоксильною групою валіну, серину, метіоніну.

21. Які види перетворень характерні для амінокислот? Наведіть приклади реакцій окислення, відновлення, гідролізу, Р-декарбокснлювання, гідроксилюванкя.

22. Дайте характеристику кінцевих продуктів обміну амінокислот.

23. Схарактеризуйте шляхи і механізми біосинтезу білків.

24. Яке співвідношення існує між матричним і нематричним механізмами синтезу білка в організмі?

25. Що таке код білкового синтезу?

26. Дайте характеристику механізмів передачі генетичної інформації та забезпечення механізмів специфічності білкового синтезу.

27. Яка роль рибосом у синтезі білка?

28. У чому полягає суть рекогніції синтезу білка? Напишіть рівняння реакції даного процесу.

29. Які ферменти беруть участь у забезпеченні процесу рекогніції?

30. Перечисліть етапи трансляції.

31. У чому полягає суть ініціації синтезу білка? Запишіть схему утворення функціонально активної рибосоми.

32. У чому полягає суть елонгації? Схарактеризуйте фактори, що беруть участь у даному процесі. '

33. У чому полягає суть термінації? За участю яких факторів здійснюється цей процес?

34. Яке значення має синтез білка для організму?

РОЗДІЛ XI. ОБМІН НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Вивчення обміну нуклеїнових кислот має важливе значення для розуміння таких загальиобіологічних проблем, як проблеми спадковості і мінливості, специфічності білків, регуляції біохімічної діяльності клітини, механізму вірусної інфекції тощо. Це пояснюється, насамперед, тим, що нуклеїнові кислоти є основними носіями спадкової інформації і відіграють провідну роль у процесах синтезу білка в організмі.