Искусственные питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам.

Питательной средойв микробиологии называют среды, содер­жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовятиз продуктов животного или рас­тительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины груп­пы В, никотиновая кислота и др.).
Искусственные средыготовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.
В бактериологической практикечаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин — кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.
По консистенциипитательные среды могут быть жид­кими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до­бавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо­бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застыв­шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сы­воротка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.
По целевому назначениюсреды подразделяют на основные, элективные и дифференци­ально-диагностические.
К основнымотносятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пита­тельный агар. Такие среды служат основой для приготов­ления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.
Элективныепитательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов определен­ного вида (или определенной группы) из материалов, содержа­щих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особен­ностей, которые отличают данные микроорганизмы от большин­ства других. Например, избирательный рост стафилококков на­блюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, хо­лерного вибриона — в щелочной среде и т. д.
Дифференциально-диагностическиепитательные среды при­меняются для разграничения отдельных видов (или групп) мик­роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи­мической активности вследствие неодинакового набора фермен­тов.
Особую группу составляют синтетические и полусинтетиче­ские питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследова­тельской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.
В последние годы в целях экономии питательных сред и уско­ренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так на­зываемые микротест-системы(МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся сте­рильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Требования, предъявляемые к питательным средам.
Любая питательная среда должна отвечать следующим тре­бованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по воз­можности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

10 классификация питательных сред по происхождению, составу, консистенции и названию. Культурные свойства микробов.
Классификация питательных сред

1. По консистенции: жидкие, полужидкие, плотные
Необходимая плотность сред создается добавлением к жидким средам 2-3% агара (агар-агар состоит из полисахаридов, получаемых из морских водорослей), обладает способностью растворяться при 100°С и застывать при комнатной температуре, создавая консистенцию геля.

2. По происхождению:

1. естественные среды готовят из натуральных продуктов (картофель, морковь, яйца, сыворотка крови и т.д.).

2. искусственные состоят из переработанных естественных продуктов (картофельный отвар, мясной бульон и т.д.) и вещества, которые получены из натуральных продуктов (пептон, дрожжевой экстракт и т.д.).

3. синтетическиесоздают из чистых химических соединений с точно известным составом (аминокислоты, углеводы, витамины, минеральные соли) (например, минимальный агар, который содержит в качестве источника азота - (NH₄)₂SO₄, а в качестве источника углерода – глюкозу).

3. По составу: 1) белковые, 2) безбелковые, 3) минеральные

4. По целевому назначению:

1. основные (простые или универсальные) – используются как самостоятельные питательные среды или в качестве питательной основы для специальных питательных сред и состоят из мясо-пептонного агара (МПА), мясо-пептонного бульона (МПБ). Такие среды готовят на основе мясного отвара с добавлением пептона, NaCl, определенного количества агара, с определенным значением pH.

2. специальные питательные среды в зависимости от цели использования подразделяют:

1. сложные – с обогащением простым сред углеводами (сахарный агар, сахарный бульон) или белками (кровяной агар, сывороточный агар или бульон, асцит-агар или асцит-бульон).

2. элективные (или избирательные) – среды, предназначенные для создания оптимальных условий для культивирования микроорганизмов определенного вида:

1. щелочной агар или щелочная пептонная вода 1% – элективность для холерного вибриона обусловлена созданием щелочной pH среды (8,0 – 8,2) в рамках которой происходит максимально быстрое размножение только данных микроорганизмов;

2. среда Ру, среда Леффлера – содержат свернутую сыворотку, необходимую для максимально быстрого роста дифтерийной палочки в сравнении с другими микроорганизмами.

3. селективные –содержащие в своем составе компоненты избирательно подавляющие рост посторонних микроорганизмов, не влияя на рост микроорганизмов искомого рода или вида:

1. селенитовая среда – с добавлением селенистого натра, для накопления патогенных шигелл, блокируя при этом рост посторонней энтерофлоры;

2. стафилококковый агар – с повышенным содержанием NaCl (до 20%), предназначена для роста и выделения стафилококков, блокируя при этом рост других микроорганизмов, не способных к размножению в повышенных концентрациях соли.

4. элективно-дифференциальные –сочетающие избирательность размножения определенных микроорганизмов и при этом возможность дифференцировать их в зависимости от характера роста:

1. желточно-солевой агар (ЖСА) – элективен для стафилококков за счет повышенного содержания NaCl и содержит лецитин для дифференциации лецитиназопозитивных (S. aureus) и лецитиназонегативных стафилококков;

2. среда Плоскирева – обуславливает избирательный рост патогенных энтеробактерий и позволяет дифференцировать лактозопозитивные и лактозонегативные микроорганизмы.

5. дифференциально-диагностические, содержащие в своем составе питательную основу, субстрат расщепления (по которому проводится дифференциация, например, лактоза) и индикатор. Данные среды позволяют дифференцировать между собой микроорганизмы одного рода или вида по определенному признаку:

1. среда Эндо и среда Левина – для дифференциации лактозопозитивных и лактозонегативных микроорганизмов;

2. среды Гисса – для дифференциации способности расщепления различных углеводов (сахаролитические свойства микроорганизмов).

6. транспортные – предназначены для транспортировки взятого материала в бактериологическую лабораторию, например, тиогликолевая среда с резазурином, сердечно-мозговой агар и др.

7. среды для культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов – среды, предназначенные для культивирования микроорганизмов в условиях создания строго искусственного анаэробиоза, например, среда Вильсон-Блёр, среда Цейсслера, клостридиум-агар, кровяной агар бактероидов (КАБ) и др.

Культуральные свойства бактерий
При росте на жидких питательных средах бактерии чаще всего вызывают равномерное помутнение, иногда — выпадение осадка: крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), бульон при этом остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками — «сталактитами» (возбудитель чумы). Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах. Образуемые при этом колонии различаются по многим признакам: размерам, форме, консистенции, структуре, прозрачности, цвету и др.

Колонии бывают очень мелкими (0,1-0,5 мм), мелкими (0,5-3,0 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупными (более 5 мм в диаметре). Они могут быть круглыми (дисковидными); плоскими; иметь форму, напоминающую львиную гриву («голову Медузы»); ризоидными и т. п.. Края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, плоская или выпуклая, а ее консистенция — плотная, рыхлая, слизистая. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и различаться по другим признакам, например у некоторых бактерий центр мутный, а периферическая зона полупрозрачна.

Все эти признаки, как правило, видоспецифичны, поэтому они имеют важное диагностическое значение, т. е. их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. Например, при определенных условиях роста колонии Salmonella paratyphi В имеют характерный слизистый валик по периферии, напоминая пуговицу с валиком.

Колонию бактерий можно рассматривать как своеобразный сложный организм. Изучение организации колонии выявило морфологическую и физиологическую гетерогенность входящих в нее клеток. В колониях сосуществуют популяции активно размножающихся, покоящихся клеток и клеток лизирующихся. Видовое своеобразие свойств колоний указывает на регулируемый характер процесса их формирования. Он управляется с помощью контактных, дистантных и, вероятно, иных сигналов и служит проявлением у бактерий апоптоза. Постоянное наблюдение за бактериями на экране монитора требует регулярного обслуживания компьютеров.

Апоптоз (греч. apoptosis — опадание лепестков цветов или листьев дерева) — форма запрограммированной клеточной гибели у эукариот, благодаря которой удаляются определенные клоны дифференцирующихся клеток или «излишки» биологического материала. Апоптоз у бактерий — аналог апоптоза эукариот — пример запрограммированного контроля над клетками на уровне популяции (колония, стационарная культура, популяции в других природных условиях). Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, а клетки другой субпопуляции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться.

Механизм генетического контроля апоптоза у Е. coli установлен. Он осуществляется особым опероном из 2 генов: mazE и mazF. Продукт гена mazF — стабильный цитотоксический белок-киллер, а продукт гена mazE — нестабильный белок MazE, разрушающий белок-киллер. Истощение фонда аминокислот в питательной среде приводит к блокированию оперона maz, в результате этого синтез белка MazE прекращается, а белок-киллер вызывает гибель и автолиз части популяции. Фонд аминокислот в среде за счет этого пополняется, синтез белка MazE у оставшихся живых клеток активируется, и они продолжают размножаться. Таким образом, апоптоз регулирует формирование колоний и поведение клеток в стационарных культурах. Возможно, этот механизм причастен и к образованию НФБ.

Культуры некоторых видов бактерий обладают характерным запахом, иногда он связан с разложением органических веществ, которое сопровождается образованием скатола, индола, сероводорода, меркаптана, масляной кислоты, аммиака и т. п. Культуры дизентерийных бактерий при росте на МПА издают запах, напоминающий запах мужского семени. Продукты жизнедеятельности ряда других видов бактерий обладают приятным ароматным запахом, который связан с образованием различных эфиров: уксусно-этилового, уксусно-амилового или диацетила. Возбудитель мочки льна, например, издает запах ананаса. Особые расы молочнокислых бактерий придают аромат пищевым продуктам.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, т. е. бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым цветом. Такие фосфоресцирующие бактерии встречаются, главным образом, в морской и речной воде. Фосфоресценция (люминесценция) продолжается иногда несколько часов и даже суток. Она представляет собой особую форму освобождения энергии возбужденных электронов. Такие бактерии нередко обнаруживаются на мясе, чешуе рыб и других объектах. К светящимся бактериям — фотобактериям — относятся физиологически сходные, но морфологически отличающиеся аэробные бактерии (вибрионы, палочки, кокки).

Биохимические свойства бактерий можно начинать изучать одновременно с выделением культуры, засевая материал на специальные питательные среды, позволяющие судить о биохимической активности выделяемых микроорганизмов.

11 бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
Бактериоскопический (микроскопический) метод- совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий (микробов) в лабораторной культуре, патологическом материале или пробах из внешней среды с помощью микроскопии. Применяют для установления диагноза инфекционного заболевания или иного вызванного микробами процесса, а также при идентификации выделенной чистой культуры. Метод бактериоскопического исследования приобретает особое значение, если микроб имеет морфологические и тинкториальные особенности или особую локализацию в тканях, клетках организма. Только при некоторых инфекциях для постановки диагноза достаточно морфологического исследования.

Для диагностики большинства инфекций микроскопия, как первый этап микробиологического исследования, имеет лишь вспомогательное, ориентировочное значение.

Ценностьбактериоскопического метода состоит в простоте, доступности методик и быстроте получения результатов (30-60 минут и менее). Однако специфичность его в связи с близостью морфологии разных видов мала, а чувствительность ограничена -разрешающаяспособность метода составляет в среднем 100 000 клеток в мл.

Микроскопические методы заключаются в приготовлении микроскопических препаратов для микроскопирования (нативных или окрашенных простыми и сложными способами) из исследуемого материала и их микроскопирование с применениемразличных видов микроскопической техники (световая, темно-польная, фазово-контрастная, люминесцентная. электронная). В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер.Тем не менее, микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕМЕТОДЫ
Классическое бактериологическое (вирусологическое, микологическое) исследование(называемое «золотым стандартом» микробиологической диагностики). Его целью является выделение и идентификация возбудителя.

Алгоритм бактериологического (вирусологического, микологического) исследования складывается из следующих основных этапов:
1) первичная микроскопия (необязательный);
2) первичный посев для выделения чистой культуры;
3) накопление чистой культуры;
4) изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры и ее идентификация. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.

Классическое микробиологическое исследование имеет ряд недостатков. Прежде всего, это достаточно длительный процесс. Его минимальный срок 3-4 дня, но могут пройти многие дни и даже недели, прежде чем выделенный возбудитель будет точно идентифицирован. Для некоторых патогенных бактерий (холерного вибриона, дифтерийных бактерий) разработаны ускоренные методы выделения и идентификации, но и они позволяют получить ответ не ранее 36-48 часов.

Задача микробиологических исследований — выделить из исследуемого материала микроорганизмы и идентифицировать, то есть определить их видовую принадлежность.

Основой микробиологических исследований является бактериологический метод диагностики, суть которого – выделение микроорганизмов в чистой культуре и их идентификация.

Патогенные свойства для идентификации: ферменты патогенности – лецитиназа, плазмакоагулаза и пр.; токсигенность – способность продуцировать экзотоксины (дифтерийная палочка, золотистый стафилококк)
Антигенные (серологические)
Фаголизабельность – способность лизироваться бактериофагами (вирусами бактерий): чувствительность к лечебным фагам (для лечения инфекционного заболевания) и чувствительность к диагностическим фагам (видовым, типовым); фаготипирование – определение чувствительности к типовым фагам, проводится с целью определения источника и путей распространения микроорганизмов в окружающей среде или среди коллектива
Бактерициночувствительность и бактериоциногения: проводиться с целью определения источника и путей распространения микроорганизмов в окружающей среде или среди коллектива
Чувствительность к антимикробным препаратам: антибиотикам,химиотерапевтическим препаратам и антисептикам, дезинфектантам.

Основной недостаток бактериологического метода — длительность исследования — от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.
Результаты многих диагностических исследований на предмет обнаружения возбудителей в значительной степени зависят от их вида, а также от времени и способа взятия патологического материала. Характер материала определяется клиническими особенностями заболевания: это должны быть те субстраты или биологические жидкости, в которых на данной стадии заболевания наиболее вероятно присутствие возбудителей. Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце, или, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, - например, при вирусных и риккетсиозных заболедваниях).

Животных заражают для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда нельзя получить ее другими способами (например, при загрязнении исследуемых объектов посторонней микрофлорой, подавляющей рост возбудителя; при незначительном содержании микроорганизмов или переходе их в фильтрующиеся формы).

Методы включают заражение чувствительных лабораторных животных (чувствительных к предполагаемому возбудителю) исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы, либо воспроизводят характерную клиническую картину.

Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм—макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста.

Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели —кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.
Недостатки:а) необходимость содержания вивария; б) длительность проведения исследования. Кроме того, даже при лабораторном заражении далеко не всегда удается выделить возбудителя, что особенно характерно для вирусных инфекций.

12 действие факторов окружающей среды на микроорганизмов.
Физические, химические и биологические факторы окружающей среды оказывают раз­личное воздействие на микроорганизмы: бак­терицидное — приводящее к гибели клетки; бактериостатическое — подавляющее размно­жение микроорганизмов; мутагенное — изме­няющее наследственные свойства микробов.

1. Влияние физических факторов
Влияние температуры.Представители различ­ных групп микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами; при средней (около 37 °С) — ме­зофилами; при высокой — термофилами.
Психрофильные микроорганизмы растут при температуре от -10 до 40 "С; температурный оп­тимум колеблется от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бакте­рий. К психрофилам относится большая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пре­сных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые психрофилы могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при темпера­туре 4 "С, а возбудитель чумы — в диапазоне от 0 до 40 °С при оптимуме роста 25 °С). В зависи­мости от температуры культивирования свойс­тва бактерий меняются. Так, Serratia marcescens образует при температуре 20-25 °С большее ко­личество красного пигмента (продигиозана), чем при температуре 37 °С. Возбудитель чумы, выращенный при 25 °С, вирулентнее, чем при 37 "С. Синтез полисахаридов, в том числе капсульных, активизируется при более низких тем­пературах культивирования.
Мезофилы растут в диапазоне температур от 10 до 47 °С, оптимум роста около 37 "С. Они включают в себя основную группу патоген­ных и условно-патогенных бактерий.
Термофильные бактерии развиваются при бо­лее высоких температурах (от 40 до 90 °С). На дне океана в горячих сульфидных водах жи­вут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С и давлении 265 атм. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности на­возом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как по­казатель загрязненности почвы.

Температурный фактор учитывается при осу­ществлении стерилизации. Вегетативные фор­мы бактерий погибают при температуре 60 °С в течение 20—30 мин., споры — в автоклаве при 120 °С в условиях пара под давлением.

Микроорганизмы хорошо переносят дейс­твие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого азота (-173 °С).
Высушивание.Обезвоживание вызывает на­рушение функций большинства микроорга­низмов. Наиболее чувствительны к высушива­нию возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и другие пато­генные микроорганизмы. Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные сли­зью мокроты. Так, бактерии туберкулеза в мок­роте выдерживают высушивание до 90 дней. Устойчивы к высушиванию некоторые капсуло- и слизеобразующие бактерии. Особой устойчивостью обладают споры бактерий. Например, споры возбудителя сибирской язвы могут сохраняться в почве столетиями.

Для продления жизнеспособности, при консервировании микроорганизмов, ис­пользуют лиофилизацию — высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные культуры микроорга­низмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохра­няются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения.Ионизирующее излу­чение применяют для стерилизации одно­разовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных ма­териалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучении, напри­мер Micrococcus radiodurans был выделен из ядерного реактора.

Неионизирующее излучение — ультрафи­олетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно дейс­твуют на микроорганизмы уже через корот­кий промежуток времени.

Ультрафиолетовые лучи, достигающие по­верхности земли, имеют длину волны 290 нм. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабо­раториях. С этой целью используют бактери­цидные лампы ультрафиолетового излучения с длиной волны 200—400 нм.

2. Влияние химических веществ
Химические вещества могут оказывать раз­личное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост; вызывать гибель. Антимикробные хими­ческие вещества используются в качестве ан­тисептических и дезинфицирующих средств, так как обладают бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т. д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным груп­пам, среди которых наиболее широко пред­ставлены хлор-, йод- и бромсодержащие со­единения и окислители.

3. Влияние биологических факторов. Микроорганизмы находятся в различ­ных взаимоотношениях друг с другом. Совместное существование двух различных организмов называется симбиозом (от греч. simbiosis — совместная жизнь). Различают несколько вариантов полезных взаимоотно­шений: метабиоз, мутуализм, комменсализм, сателлизм.
Метабиоз— взаимоотношение микроор­ганизмов, при котором один из них исполь­зует для своей жизнедеятельности продукты жизнедеятельности другого. Метабиоз ха­рактерен для почвенных нитрифицирую­щих бактерий, использующих для своего метаболизма аммиак — продукт жизнеде­ятельности аммонифицирующих почвен­ных бактерий.
Мутуализм— взаимовыгодные взаимо­отношения разных организмов. Примером мутуалистического симбиоза являются ли­шайники — симбиоз гриба и сине-зеленой водоросли. Получая от клеток водоросли ор­ганические вещества, гриб, в свою очередь, поставляет им минеральные соли и защищает от высыхания.
Комменсализм(от лат. commensalis — со­трапезник) — сожительство особей разных видов, при котором выгоду из симбиоза извлекает один вид, не причиняя другому вреда. Комменсалами являются бактерии — представители нормальной микрофлоры че­ловека
Сателлизм— усиление роста одного ви­да микроорганизма под влиянием другого вида микроорганизма. Например, колонии дрожжей или сарцин, выделяя в питательную среду метаболиты, стимулируют рост вокруг них колоний других микроорганизмов. При совместном росте нескольких видов мик­роорганизмов могут активизироваться их физиологические функции и свойства, что приводит к более быстрому воздействию на субстрат.
Антагонистические взаимоотношения, или антагонистический симбиоз, выражаются в виде неблагоприятного воздействия одного вида микроорганизма на другой, приводяще­го к повреждению и даже гибели последнего. Микроорганизмы-антагонисты распростра­нены в почве, воде и в организме человека и животных. Хорошо известна антагонистичес­кая активность против посторонней и гни­лостной микрофлоры представителей нор­мальной микрофлоры толстого кишечника человека — бифидобактерий, лактобактерий, кишечной палочки и др.
Механизм антагонистических взаимоотно­шений разнообразен. Распространенной фор­мой антагонизма является образование анти­биотиков — специфических продуктов обме­на микроорганизмов, подавляющих развитие микроорганизмов других видов. Существуют и другие проявления антагонизма, например, большая скорость размножения, продукция бактериоцинов, в частности колицинов, про­дукция органических кислот и других продуктов, изменяющих рН среды.
Антагонизм может развиваться в форме конкуренции в основном за источники пита­ния: интенсивно развиваясь и истощая пи­тательную среду, микроорганизм-антагонист подавляет рост других микроорганизмов. При хищничестве микроорганизм, например, аме­ба кишечника, захватывает и переваривает бактерии кишечника. Наконец, такая форма антагонизма, когда микроорганизм исполь­зует другой организм как источник питания, называется паразитизмом. Примером пара­зитизма является взаимоотношение бактериофага и бактерии, а также взаимоотношение бделловибрионов (маленькие бактерии, пара­зиты обычных грамотрицательных бактерий).

13 понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике. Методы стерилизации и аппаратура. Понятие о микробоцидном и микробостатическом действии.
Влияние температуры.Различные группы микроорга­низмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при вы­сокой — термофилами.
К психрофильным микроорганизмам относится боль­шая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бакте­рии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при темпера­туре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свой­ства бактерий меняются. Интервал температур, при кото­ром возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, прибли­жаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.
Мезофилы включают основную группу патогенных и услов­но-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развива­ются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С и давлении 262 атм.
Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания на­воза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компос­том. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассмат­ривают как показатель загрязненности почвы.
Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких тем­ператур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном со­стоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С).
Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функ­ций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гоно­реи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособнос­ти, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные куль­туры микроорганизмов и иммунобиологические препараты дли­тельно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения. Неионизирующее излучение — уль­трафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных ве­ществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предме­тов в больницах, родильных домах, микробиологических лабо­раториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм.
Ионизирующее излучение применяют для стерилизации од­норазовой пластиковой микробиологической посуды, питатель­ных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию иони­зирующих излучений, например, Micrococcus radioduransбыла вы­делена из ядерного реактора.

Действие химических веществ.Химические вещества могут ока­зывать различное действие на микроорганизмы: служить источ­никами питания; не оказывать какого-либо влияния; стимули­ровать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфи­цирующими. Антимикробные хи­мические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, отно­сятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.
Стерилизация– предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.
Дезинфекция— процедура, пре­дусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтоже­ния до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании дан­ного предмета. Как правило, при дезинфек­ции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.
Асептика– комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.
Антисептика– совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.
Стерилизацияпредполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергающихся обработке.
Существует три основных метода стерили­зации: тепловой, лучевой, химической.
Тепловая стерилизацияоснована на чувстви­тельности микробов к высокой температуре. При 60 "С и наличии воды происходит денату­рация белка, деградация нуклеиновых кислот, липидов, вследствие чего вегетативные фор­мы микробов погибают. Споры, содержащие очень большое количество воды в связанном состоянии и обладающие плотными оболоч­ками, инактивируются при 160—170 °С.

Для тепловой стерилизации применяют, в основном, сухой жар и пар под давлением.
Стерилизацию сухим жаром осуществля­ют в воздушных стерилизаторах (прежнее название — «сухожаровые шкафы или печи Пастера»). Воздушный стерилизатор представляет собой металлический плотно закры­вающийся шкаф, нагревающийся с помощью электричества и снабженный термометром. Обеззараживание материала в нем произво­дят, как правило, при 160 °С в течение 120 мин. Однако возможны и другие режимы: 200 °С - 30 мин, 180 "С - 40 мин.

Стерилизуют сухим жаром лабораторную посуду и другие изделия из стекла, инстру­менты, силиконовую резину, т. е. объекты, которые не теряют своих качеств при высокой температуре.

Большая часть стерилизуемых предметов не выдерживает подобной обработки, и поэтому их обеззараживают в паровых стерилизаторах.
Обработка паром под давлением в паровых стерилизаторах (старое название — «автокла­вы») является наиболее универсальным мето­дом стерилизации.
Паровой стерилизатор (существует множес­тво его модификаций) — металлический цилиндр с прочными стенками, герметически закрывающийся, состоящий из водопаровой и стерилизующей камер. Аппарат снабжен манометром, термометром и другими конт­рольно-измерительными приборами. В авто­клаве создается повышенное давление, что приводит к увеличению температуры кипения.

Поскольку кроме высокой температуры на микробы оказывает воздействие и пар, споры погибают уже при 120 °С. Наиболее распростра­ненный режим работы парового стерилизатора: 2 атм — 121 °С — 15—20 мин. Время стерилиза­ции уменьшается при повышении атмосфер­ного давления, а, следовательно, и температуры кипения (136 °С — 5 мин). Микробы погибают за несколько секунд, но обработку материала производят в течение большего времени, так как, во-первых, высокая температура должна быть и внутри стерилизуемого материала и, во-вторых, существует так называемое поле безопасности (рассчитанное на небольшую не­исправность автоклава).

Стерилизуют в автоклаве большую часть предметов: перевязочный материал, белье, коррозионно-устойчивые металлические инструменты, питательные среды, растворы, инфекционный материал и т. д.

Одной из разновидностей тепловой стери­лизации является дробная стерилизация, ко­торую применяют для обработки материалов, не выдерживающих температуру выше 100 °С, например, для стерилизации питательных сред с углеводами, желатина. Их нагревают в во­дяной бане при 80 °С в течение 30—60 мин.

В настоящее время применяют еще один метод тепловой стерилизации, предназначен­ный специально для молока — ультравысоко­температурный(УВТ): молоко обрабатывают в течение нескольких секунд при 130—150 °С.

Химическая стерилизацияпредполагает ис­пользование токсичных газов: оксида этилена, смеси ОБ (смеси оксида этилена и бро­мистого метила в весовом соотношении 1:2,5) и формальдегида. Эти вещества являются алкилирующими агентами, их способность в присутствии воды инактивировать активные группы в ферментах, других белках, ДНК и РНК приводит к гибели микроорганизмов.
Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при температуре от 18 до 80 °С в специальных камерах. В больницах используют формальдегид, в промышленных условиях — оксид этилена и смесь ОБ.

Перед химической стерилизацией все из­делия, подлежащие обработке, должны быть высушены.
Этот вид стерилизации небезопасен для персонала, для окружающей среды и для пациентов, пользующихся простерилизованными предметами (большинство стерилизующих агентов остается на предметах).

Однако существуют объекты, которые мо­гут быть повреждены нагреванием, например, оптические приборы, радио- и электронная аппаратура, предметы из нетермостойких по­лимеров, питательные среды с белком и т. п., для которых пригодна только химическая сте­рилизация. Например, космические корабли и спутники, укомплектованные точной аппаратурой, для их деконтаминации обезв­реживают газовой смесью (оксид этилена и бромистого метила).
В последнее время в связи с широким рас­пространением в медицинской практике изде­лий из термолабильных материалов, снабжен­ных оптическими устройствами, например, эндоскопов, стали применять обезврежива­ние с помощью химических растворов. После очистки и дезинфекции прибор помещают на определенное время (от 45 до 60 мин) в сте­рилизующий раствор, затем прибор должен быть отмыт стерильной водой. Для стери­лизации и отмывки используют стерильные емкости с крышками. Простерилизованное и отмытое от стерилизующего раствора изделие высушивают стерильными салфетками и по­мещают в стерильную емкость. Все манипу­ляции проводят в асептических условиях и в стерильных перчатках. Хранят эти изделия не более 3 суток.

Лучевая стерилизацияосуществляется либо с помощью гамма-излучения, либо с помо­щью ускоренных электронов.
Лучевая стерилизация является альтернати­вой газовой стерилизации в промышленных условиях, и применяют ее также в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдержи­вают высокой температуры. Лучевая стерили­зация позволяет обрабатывать сразу большое количество предметов (например, одноразо­вых шприцев, систем для переливания крови). Благодаря возможности широкомасштабной стерилизации, применение этого метода впол­не оправданно, несмотря на его экологичес­кую опасность и неэкономичность.
Еще одним способом стерилизации является фильтрование. Фильтрование с помощью раз­личных фильтров (керамических, асбестовых, стеклянных), а в особенности мембранных уль­трафильтров из коллоидных растворов нитроцеллюкозы или других веществ позволяет освободить жидкости (сыворотку крови, лекарства) от бак­терий, грибов, простейших и даже вирусов. Для ускорения процесса фильтрации обычно создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом.
В настоящее времявсе более широкое при­менение находят современные методы стери­лизации, созданные на основе новых техно­логий, с использованием плазмы, озона.

14 строение генома бактерий. Понятие о геноме и фенотипе. Виды изменчивости.
Бактериальный геномсостоит из генети­ческих элементов, способных к самостоятель­ной репликации, т. е. репликонов. Репликонами являются бактери­альная хромосома и плазмиды.
Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют после­довательность аминокислот в белке. Каждому белку соответствует свой ген, т. е. дискретный участок на ДНК, отличаю­щийся числом и специфичностью последова­тельности нуклеотидов.
Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой фор­мы. Размеры бактериальной хромосомы у различ­ных представителей царства Procaryotae варьируют. Бактериальная хромосома формиру­ет компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный на­бор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.
Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преиму­щества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Свойства микроор­ганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти синоним по­нятия «генотип».
Фенотиппредставляет собой результат взаимодействия меж­ду генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки фе­нотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

В основе изменчивостилежит либо изменение реакции гено­типа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В свя­зи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на про­явление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего моди­фикацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, — мутационная изменчивость. Основу мутации со­ставляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная пе­рестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде изме­нённого признака.

Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.

Подвижные генетические элементы.
В состав бактериального генома, как в бак­териальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.

Вставочные (инсерционные) последова­тельности IS-элементы— это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транс­позиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в но­вый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повто­ров. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза. Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы це­пей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок.

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе кото­рого они находятся.

Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по раз­мерам и по типам и количеству инвертиро­ванных повторов.

Транспозоны — это сегменты ДНК, облада­ющие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладаю­щих специфическим биологическим свойс­твом, например, токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

Перемещаясь по репликону или между реп­ликонами, подвижные генетические элемен­ты вызывают:

1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.

2. Образование повреждений генетического материала.

3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.

4. Распространение генов в популяции бак­терий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процес­сам среди микробов.

Изменения бактериального генома, а следо­вательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.