Приготування препаратів фіксованих клітин. Прості методи забарвлення

Мета роботи: Ознайомлення з методикою приготування препаратів фіксованих клітин та простими методами забарвлення.

Теоретичні основи: Для виявлення деяких морфологічних особливостей та кількісного обліку мікроорганізмів, перевірки чистоти культури та інших цілей готують фіксовані забарвлені препарати.

Фіксація препаратів має мету:

- вбити мікроорганізми та зробити безпечною подальшу роботу з ними;

- забезпечити краще прили­пання клітин до скла;

- зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення.

Забарвлення препаратів виконується аніліновими барвниками. За хімічною класифікацією вони поділяються на три групи: кислі, ос­новні та нейтральні.

Кислі барвники містять у своїх молекулах групи –SO₃H, -COOH та мають властивості кислот. Основні барвники ма­ють у своєму складі аміногрупи, котрі надають їм властивості основ. Нейтральні барвники не містять у складі кислотних груп та аміногруп і не мають спільних властивостей з кислотами та лугами.

Основні барвники, у яких забарвлююча частина молекули заряджена позитивно, виявляють найбільшу здатність вступати у спо­лучення з бактеріальною клітиною, яка несе на поверхні негативний електричний заряд та має у складі цитоплазми, у переважній кількості, кислі компоненти.

Найбільш широко використовуються такі барвники: червоні (фуксин основний, фуксин кислий), сині (метиленовий та то­луїдиновий сині), фіолетові (генциан віолет, метиловий фіолетовий, кристалічний фіолетовий), жовто-коричневі (везувін, хризоїдин), зелені (діамантовий зелений, малахітовий зелений).

Виділяють прості та диференційні методи забарвлення.

При простому забарвленні використовується один вид барвника, який дає змогу рівномірно забарвити всю клітину, так що добре видна її фор­ма та розмір.

Диференційні методи забарвлення передбачають вико­ристання кількох барвників та переслідують ціль виявлення окремих структур та компонентів клітин.

Приготування фіксованих забарвлених препаратів включає на­ступні етани:

- приготування мазка;

- висушування;

- фіксацію;

- забарв­лення.

Матеріали, реактиви й устаткування:

Мікроскопи, культура мікроорганізмів, предметні та покривні скельця, стерильна вода у пробірках, газові пальники, бактеріологічні петлі, барвники: 0,01% розчин метиленового синього, водний розчин фуксину основного, кристалізатор з підставкою для предметних скелець, фільтрувальний папір, імерсійна олія, дезінфікуючий розчин, марлеві серветки.

Хід роботи:

Приготувати та провести простий метод забарвлення культури мікроорганізмів по наступній схемі:

1. Приготування мазка

На знежирене предметне скельце наносять краплю стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину та вносять в неї петлею невелику кількість матеріалу, який досліджується. Отриману суспензію розмазують петлею тонким шаром по поверхні предметного скельця на площі 1 - 2 см².

2. Висушування мазка

Препарат сушать при кімнатній температурі. Для скорочення часу висихання препарату, допускається легке нагрівання його над полум'ям пальника у струмені теплого повітря. Скельце необхідно тримати мазком доверху. Не можна допускати перегрівання мазка, бо можлива деформація мікроорганізмів.

3. Фіксація

Найбільш простим способом фіксації є термічна обробка. Для цього препарат 3-5 разів швидко проводять через найбільш гарячу частину полум'я пальника, тримаючи скельце мазком доверху. Цю операцію слід проводити вкрай обережно, не перегріваючи мазка і не допускаючи зміни клітинних структур та зовнішнього виду клітин.

Для дослідження внутрішньої будови клітини вдаються до фіксації різними хімічними речовинами. У цьому випадку фіксуючу рідинуналивають на мазок або занурюють препарат у склянку з фіксатором. Для фіксації використовують етиловий спирт (час фіксації І5 – 20 сек.), метиловий спирт (3 - 5 хв.). Існує цілий ряд інших фіксаторів. Після закінчення фіксації препарат відмивають від фіксатора у тонкому струмені водопровідної води та забарвлюють.

4. Забарвлення

Для простого забарвлення клітин мікроорганізмів найчастіше використовують фуксин або метиленовий синій. Фіксований препа­рат кладуть мазком доверху на місток з двох паралельних скляних паличок, які з'єднані гумовими трубочками та покладені на стінки кювети або кристалізатора. Піпеткою наносять на мазок 2-3 крап­лини водного розчину фуксину, щоб він покрив увесь мазок. Забарвлення проводять протягом 2-3 хвилин. Після закінчення забарвлен­няструменем води змивають з препарату барвник. Препарат вису­шують на повітрі або легко промокають фільтрувальним папером. Препарат мікроскопіюють з об'єктивом 40х та 90х.

У правильно забарвленому та добре промитому препараті поле зору залишається світлим та чистим, а забарвленими виявляються клітини мікроорганізмів.

Контрольні питання:

1. З якою метою готують препарати фіксованих клітин?

2. Чим відрізняються препарати живих і фіксованих клітин?

3. Хімічна класифікація барвників.

4. Методика приготування препаратів фіксованих клітин.

Форма звітного бланка до лабораторної роботи №3.

Група	Курс	Лабораторна робота №3
		Приготування препаратів фіксованих клітин. Прості методи забарвлення.
Прізвище студента
1) Рисунок культури мікроорганізмів …………………………………… при збільшенні (назва препарату мікроорганізмів латинською) а) 40х б) 90х 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №3
Роботу прийняв		Дата		Підпис

Лабораторна робота №4