Микробиологическая диагностика бешенства.

Вирусоскопические, биологические и серологические методы. Материал: слюна, кровь, секционный материал (мозг, подчелюстные слюнные железы). Микроскопия: в ткани мозга находят эозинофильные тельца Бабеша-Негри, размером 5-10 мкм – это скопления вирусных нуклеокапсидов. Имеют неровные очертания.

Аг вируса обнаруживают с помощью РИФ. Заражение животных внутримозговым путём.

АТ к вирусу определяют в РСК, РН, РИФ.

Особенности репликации вирусов с 1 нитью ДНК.

Это – IV стадия репродукции вирусов: синтез вирусных белков и репликация нуклеиновых к-т.

У ДНК-вирусов вначале транскрибируются так называемые ранние гены, кот-е контролируют образование вирусспецифической ДНК-полимеразы. Это происходит при участии РНК-полимеразы хозяина. Только у вируса оспы есть собственная РНК-полимераза.

Образуется «ранняя» вирусная и-РНК, она транслируется на рибосомы клетки, где синтезируется ДНК-полимераза. С помощью этой полимеразы происходит репликация вирусной ДНК, образуется «фонд» ДНК, кот-й используется для сборки вирусных частиц.

Этот процесс происходит в ядре, кроме поксвирусов (у них – в цитоплазме).

Особенности репликации вирусов с 1 нитью РНК.

Это – IV стадия репродукции вирусов: синтез вирусных белков и репликация нуклеиновых к-т.

У РНК-содержащих вирусов репликация идёт по 3-м путям:

1. РНК пикорнавирусов выполняет роль и-РНК, транслируется на рибосомы, служит матрицей для образования единого гигантского полипептида. Последний расщепляется на несколько белков, один из кот-х является полимеразой. Начинается репликация той же РНК, освобождённой от рибосом.

2. РНК других вирусов служит матрицей, на кот-й транскрибируется и-РНК. Она транслируется на рибосомы, образуются определённые вирусные белки, один из кот-х - полимераза. Далее происходит репликация вирусной РНК, причём вначале образуется форма из 2-х нитей.

3.У онкогенных РНК-содержащих вирусов синтез идёт иначе. С матрицы РНК образуется ДНК-копия, имеющая 1 нить ДНК. В этом процессе участвует обратная транскриптаза, кот-я есть в вирионе. Затем идёт репликация этой нити ДНК, образуется 2 нити. На матрице этой ДНК-копии синтезируются молекулы РНК.

54. Какая разница между (+) и (-) вариантами 1-нитчатых РНК геномов?

Вирусные РНК делятся на + нити и - нити РНК.

+РНК представлены одиночными цепочками, имеющими характерные «шапочки» на концах для распознавания рибосом. К этой группе относят РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомах заражённой клетки, то есть выполнять ф-и м-РНК. Ф-и +нитей: служат м-РНК для синтеза структурных белков, матрицей для репликации РНК, упаковываются в капсид с образованием дочерней популяции.

-РНК не способны транслировать генетическую информацию на рибосомах. Служат матрицей для синтеза м-РНК.

Сущность радиоиммунного метода.

Используют очищенные и концентрированные Аг и АТ, меченные радиоизотопом (йодом).

Для выявления АТ – к исследуемой сыворотке добавляют меченый Аг. Титр АТ в сыворотке устанавливают по убыли свободного меченого Аг.

Для выявления Аг – исследуемый материал смешивают с антисывороткой, затем вносят гомологичный меченый Аг. Если меченый Аг остаётся свободным, реакция положительная, так как исследуемый Аг связался с сывороткой. Если меченый Аг уменьшается, это означает, что он взаимодействует с сывороткой – реакция отрицательная.

Используют для диагностики вирусного гепатита.

ВИЧ.

1. Как происходит заражение ВИЧ?

ВИЧ-инфекция – типичный антропоноз, у животных воспроизвести заболевание не удаётся. Резервуар вируса – инфицированный человек. Пути передачи:

1. Половой – через повреждения слизистых.

2. Использование одних игл и шприцев наркоманами.

3. Гемотрансфузионный – переливание крови и её препаратов.

4. Передача с донорскими органами.

ВИЧ чувствителен к д-ю высоких t°, этанола, эфира. В биологическом материале при комнатной t° жизнеспособен несколько дней.

2. Какие клетки поражает ВИЧ и какой рецептор имеют эти клетки? Мех-м развития ВИЧ.

Мишени для ВИЧ – Т-хелперы, моноциты, макрофаги, клетки микроглии.

Патогенез поражений: селективное поражение CD4⁺-клеток, так как вирус использует CD4 как рецептор. В патогенезе 4 стадии:

I. Апоптоз – «запрограммированная» смерть клеток – при взаимодействии вирусов с рецепторной системой макрофагов нарушается «распознавание» вируса как чужеродного Аг.

II. Образование синцитиев – вирусы выходят в кровь и внедряются в новые незаражённые лимфоциты. Здоровые лимфоциты прилипают к поражённым. Активность лимфоцитов снижается под д-ем токсинов, образующихся при гибели клеток.

III. Аутоиммунные реакции – появление вирусных гликопротеинов на мембранах Т-хелперов приводит к активации Т-киллеров. Иммунная система не может противостоять даже сапрофитной флоре. Возникают «оппортунистические» инфекции.

IV. Инфицирование клеток-предшественников – при нормальном иммунитете эти клетки разрушаются, а в условиях иммунодефицита – активно размножаются. Возникают болезни злокачественного роста – саркома Капоши.

«Оппортунистические» инфекции – заболевания, вызванные микроорганизмом, способным поражать только индивидуумы с ослабленным иммунитетом.

3. Как устроен ВИЧ?

ВИЧ входит в состав ретровирусов. Характерно: уникальное строение генома и наличие обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза обеспечивает обратную направленность потока генетической информации – от РНК к ДНК (отсюда название).

Геном: 2 идентичные молекулы 1-нитевой несегментированной +РНК.

При репродукции образуются промежуточные продукты ДНК – особенности размножения ретровирусов. Выделяют ВИЧ-I и ВИЧ-II.

Зрелые вирионы: сферическая форма, d = 120 нм, в геноме 2 нити +РНК, капсид, суперкапсид из двойного липидного слоя, кот-й пронизывают гликопротеиновые шипы. Эти шипы взаимодействуют с молекулами CD4 на мембранах клетки.

4. Сколько генов имеет ВИЧ, какие белки они контролируют?

У ВИЧ главные Аг:

· группо- и видоспецифичные Аг – сердцевинные белки p24;

· типоспецифичные Аг – оболочечные белки gp41 и gp120.

В соответствии с их структурой выделяют 2 типа и более 10 сероваров ВИЧ.

Структурные гены (gag, pol, env) кодируют белки, входящие в структуру вириона. Ген «env» кодирует синтез наружной оболочки, «gag» - внутренней и «pol» - обратной транскриптазы.

Регуляторные гены: ген «tat» необходим для репликации вируса; ген «rev» кодирует синтез белка, ускоряющего трансляцию; ген «nef» кодирует синтез белка – эндогенного ингибитора репликации вируса; ген «vif» - вирусный инфекционный фактор.

Ф-и других генов не ясны.

5. С помощью какой серологической реакции можно определить ВИЧ?

Основа диагностики – выявление вирусспецифических АТ и Аг вируса.

Основные методы – ИФА и иммуноблот. ИФА – основной метод, но для ранней диагностики менее предпочтителен, так как у 95% инфицированных людей АТ появляются только через 2-5 мес. Иммуноблот применяют для подтверждения факта ВИЧ-инфекции.

Иммуноблотинг.

Метод идентификации Аг (или АТ) с помощью известных сывороток (или Аг). Применяют для подтверждения ВИЧ. Сначала электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (бумагу) и продолжают электрофорез. Потом на бумагу наносят сыворотку пациента и инкубируют. После отмывания несвязавшихся АТ проводят ИФА – на плёнку (на бумагу) наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченую ферментом, и хромогенный субстрат. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка на носителе появляются окрашенные пятна.