Спектр используемых антибиотиков
Леч., пед. ф-ты, 2006
ЗАНЯТИЕ 29
Тема: Микробиологическая диагностика риккетсиозов, хламидийных и микоплазменных инфекций.
Цель: На основе знаний биологии микоплазм, риккетсий и хламидий, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.
Знать:
1. Классификацию и морфобиологические особенности возбудителей риккетсиозов, хламидийных и микоплазменных инфекций.
2. Экологию, особенности патогенеза и иммунитета при риккетсиозах, хламидийных и микоплазменных инфекциях.
3. Материал и методы микробиологической диагностики риккетсиозов, хламидийных и микоплазменных инфекций.
4. Специфическую профилактику риккетсиозов.
5. Неспецифическую профилактику и этиотропную терапию хламидийных и микоплазменных инфекций.
Уметь:
1. Учитывать и оценивать результаты РСК для определения общего титра антител и класса Ig при серологической диагностике эпидемического сыпного тифа, болезни Брилля-Цинссера.
2. Учитывать и оценивать результаты РПГА для определения общего титра антител при серологической диагностике северо-азиатского риккетсиоза.
3. Учитывать и оценивать результаты непрямой РИФ и ПЦР с материалом обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз.
4. Учитывать и оценивать результаты ИФА с сывороткой обследуемого и хламидийным антигеном.
5. Учитывать и оценивать результаты биохимического теста с материалом обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз.
6. Учитывать и оценивать результаты определения чувствительности возбудителя урогенитального микоплазмоза к антибиотикам.
Контрольные вопросы:
1. Систематическое положение возбудителей риккетсиозов, хламидийных и микоплазменных инфекций.
2. Морфобиологическая характеристика возбудителей риккетсиозов, хламидийных и микоплазменных инфекций.
3. Экология, эпидемиология, особенности патогенеза и иммунитета при риккетсиозах, хламидийных и микоплазменных инфекциях.
4. Материалы и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых риккетсиями, хламидиями, микоплазмами.
5. Специфическая профилактика риккетсиозов (эпидемического сыпного тифа, Q-лихорадки).
6. Неспецифическая профилактика и этиотропная терапия хламидийных и микоплазменных инфекций.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести серологическое исследование по обнаружению антител и класса Ig в сыворотке крови больного с клиническим диагнозом “Эпидемический сыпной тиф? Болезнь Брилля-Цинссера?”, для чего:
1.1. Учесть и оценить результаты реакции связывания комплемента (РСК) с сывороткой крови больного и риккетсиозным антигеном.
1.2. Учесть и оценить результаты РСК с сывороткой того же больного, обработанной цистеином и риккетсиозным антигеном.
По результатам исследований сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
2. Провести серологическое исследование по обнаружению антител в парных сыворотках больного с подозрением на северо-азиатский риккетсиоз, для чего:
2.1. Учесть и оценить результаты РНГА с парными сыворотками крови больного и эритроцитарным диагностикумом из R. sibirica.
По результатам исследований сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
3. Провести микробиологическую диагностику урогенитального хламидиоза, для чего:
3.1. Учесть и оценить РИФ непрямую с материалом от обследуемого.
3.2. Учесть и оценить ПЦР с материалом от того же обследуемого.
3.3. Учесть и оценить ИФА с сывороткой того же обследуемого и хламидийным антигеном C. trachomatis.
На основании полученных результатов сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
4. Провести исследование соскоба из цервикального канала от обследуемой с бесплодием с помощью тест-системы Mycoplasma DUO, для чего:
4.1. Выявить наличие микоплазм и определить их количество.
4.2. Определить чувствительность культуры к антибиотикам.
На основании полученных результатов сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
5. Описать биопрепараты: живая сыпнотифозная вакцина, диагностикумы из R. prowazeki, R. typhi; типовые риккетсиозные сыворотки.
6. Ознакомиться с тест-системой ИФА для определения антител к C. trachomatis и антигена C. trachomatis.
Методические указания, выполняемые в ходе УИРС:
I. Проведите серологическое исследование по обнаружению антител и класса Ig в сыворотке крови больного с клиническим диагнозом “Эпидемический сыпной тиф? Болезнь Брилля-Цинссера?”, для чего:
1.1. Учтите и оцените результаты РСК с сывороткой крови больного и риккетсиозным антигеном.
Серологическая диагностика эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля-Цинссера основана на определении общего титра специфических антител. Критерием оценки при однократно взятой сыворотке является диагностический титр, равный в РСК 1:160-1:200.
1.2. Учтите и оцените результаты РСК с сывороткой того же больного, обработанной цистеином и риккетсиозным антигеном.
Критерием дифференциации первичного заболевания (эпидемического сыпного тифа) и рецидива (болезни Брилля-Цинссера) является класс образующихся Ig – IgM и IgG. При первичной инфекции наблюдается динамика образования Ig – в начале IgM, а затем IgG. При рецидиве не зависимо от периода заболевания образуются IgG.
Возможность дифференцировать IgM и IgG основана на их различной чувствительности к действию редуцирующих веществ (2-меркаптоэтанола, цистеина и др.), которые вызывают разрыв дисульфитных связей в молекуле IgM и образование субъединиц, не обладающих антительной активностью. При этом молекулы IgG не разрушаются и сохраняют антительную активность. Исходя из вышеизложенного, ставят серологическую реакцию (РА, РСК) с нативной сывороткой и той же сывороткой, обрабатываемой редуцирующим веществом. Снижение титра антител в 2 и более раз свидетельствует о наличии IgМ; снижение титра антител не более, чем в 2 раза свидетельствует о наличии только IgG.
По результатам исследований сформулируйте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
II. Проведите серологическое исследование по обнаружению антител в парных сыворотках больного с подозрением на северо-азиатский риккетсиоз, для чего:
2.1. Учтите и оцените результаты РПГА с парными сыворотками крови больного и эритроцитарным диагностикумом из R. sibirica (см. занятие №10).
РПГА ставят по обычной методике с использованием антигена R. sibirica, адсорбированного на эритроцитах. Критерием оценки при исследовании парных сывороток является нарастание титра антител в 2 и более раз.
По результатам исследований сформулируйте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
III. Проведите микробиологическую диагностику урогенитального хламидиоза, для чего:
3.1. Учтите и оцените РИФ непрямую с материалом от обследуемого (см. занятие №11).
Результат РИФн считается положительным, если в мазке выявляют ярко-зеленые светящиеся мелкие, круглые (элементарные тельца хламидий) или овальные (ретикулярные тельца хламидий) частицы. Тельца располагаются отдельно, на поверхности эпителиальных клеток или внутриклеточно. Эпителиальные клетки окрашены в красно-оранжевый цвет.
Результат считается отрицательным, если в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 50 эпителиальных клеток.
3.2. Учтите и оцените ПЦР с материалом от того же обследуемого (см. занятие №8).
3.3. Учтите и оцените ИФА с сывороткой обследуемого на урогенитальный хламидиоз и хламидийным антигеном C. trachomatis (см. занятие №11).
На основании полученных результатов сформулируйте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
IV. Проведите исследование соскоба из цервикального канала от обследуемой с бесплодием с помощью тест-системы Mуcoplasma DUO, для чего:
4.1. Выявите наличие микоплазм и определите их количество.
Набор Mуcoplasma DUO позволяет культивировать, идентифицировать и дифференциально титровать урогенитальные микоплазмы, а также определять чувствительность культур к антибиотикам. Метод позволяет получить результаты в течение 24-48 ч.
Материалом для исследования являются соскобы из уретры, эндоцервикального канала, влагалища (реже – из глотки, назофарингиальной зоны, конъюнктивы у детей). Так как микоплазмы прилипают к поверхности эпителиальных клеток, следует хорошо поскоблить слизистую. Затем тампончик (предпочтительно специальный цитологический тампончик Bactopick) погружается в 2 мл транспортной среды и взбалтывается, чтобы смыть все клетки в среду.
Идентификация и титрование урогенитальных микоплазм основаны на специфических метаболических свойствах каждого микроорганизма, которые гидролизуют:
- Ureaplasma urealiticum (UU) – мочевину;
- Mycoplasma hominis (MH) – аргинин.
При этом образуется ион аммония и происходит защелачивание среды. Вследствие этого изменяется цвет (с желтого на красный) индикатора кислотности (рН) среды, что позволяет визуализировать реакцию. Таким образом, при желтой окраске содержимого лунок – микоплазмы отсутствуют, при красной окраске – микоплазмы присутствуют в пробе. Если покраснело содержимое лунки U – в пробе присутствует UU, если покраснело содержимое лунки Н – в пробе присутствует МН, если покраснело содержимое лунок U и Н – в пробе присутствуют и UU, и МН.
Т и т р о в а н и е (определение количества) основано на принципе разведения исследуемого материала в жидкой среде. Проба последовательно разводится в транспортной среде, в лунке D (разведение 10-1) и, наконец, в лунках U > 104 и Н > 104 (разведение 10-2). Таким образом, может быть определен титр микоплазм. Этот титр соответствует лунке, цвет которой изменился на красный через 24-48 ч инкубации.
Данный набор позволяет определить титры порядка 10-3 – 10-4 мл, которые считаются этиологически значимыми.
Учет результатов: первые результаты считываются через 24 ч инкубации. При наличии положительной реакции в лунке с высоким титром (104), получают окончательный результат. Второй раз считывают результаты через 48 ч в следующих случаях:
- если нужно подтвердить отрицательный результат,
- определить присутствие микоплазм в низких титрах,
- определить штаммы, присутствующие в высоком титре, но характеризующиеся медленным метаболизмом.
4.2. Определите чувствительность культуры к антибиотикам.
Микроплата для определения чувствительности к антибиотикам включает два ряда по 8 лунок, содержащих различные антибиотики. Разные концентрации антибиотиков в лунках позволяют получить профиль чувствительности тестируемых микоплазм (чувствительная, умеренно устойчивая, устойчивая). Лунки Тс служат контролем роста без антибиотиков. Определение осуществляется с использованием содержимого лунки Х набора Mуcoplasma DUO.
Оценка-интерпретация. Тест интерпретируется тогда, когда контрольные лунки роста изменят цвет с желтого на красный. На практике плата исследуется через 24 ч и снова через 48 ч для установления низкой резистентности:
- 2 желтых лунки – отсутствие роста (чувствительна);
- 2 красных лунки – рост в присутствии антибиотиков (устойчива);
- лунка с низкой концентрацией антибиотика – красная, лунка с высокой концентрацией антибиотиков – желтая (умеренно устойчива).
Для клиндамицина и пристинамицина используется лишь одна концентрация антибиотика, поэтому возможны только два варианта результата: культура чувствительная или устойчивая.
Спектр используемых антибиотиков
| Название антибиотика | Код антибиотика |
| Офлоксацин (1 мг/л и 4 мг/л) | OFX1, OFX4 |
| Клиндамицин (2 мг/л) | CM2 |
| Пристинамицин (2 мг/л) | PT2 |
| Эритромицин (1 мг/л и 4 мг/л) | E1, E4 |
| Джозамицин (2 мг/л и 8 мг/л) | JM2, JM8 |
| Тетрациклин (4 мг/л и 8 мг/л) | TE4, TE8 |
| Миноциклин (4 мг/л и 8 мг/л) | MNO4, MNO8 |
| Доксициклин (4 мг/л и 8 мг/л) | DO4, DO8 |
| Контроль пророста без антибиотиков | Tc, Tc |
На основании полученных результатов сформулируйте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.