Применение метода УФ-спектроскопии в молекулярной биологии и биофизике.
Метод УФ-спектроскопии используют как для идентификации веществ (например, оснований аденин, тимин, гуанин, цитозин в нуклеотидном составе ДНК), так и для количественного анализа. Например, для определения содержания ДНК в бактериофагах или концентраций бактерий. Также его можно использовать для определения структурных параметров макромолекул (например меры a - спиральности белка). По спектральным измерениям можно контролировать взаимодействие молекул белка и определять условия, кинетику этого процесса.
Методом УФ-спектроскопии исследуют переходы спираль – клубок в белках или двухцепочечной ДНК: денатурацию и ренатурацию при изменении рН, температуры, ионной силы. Хромофор, спрятанный внутри белка при денатурации (разворачивании макромолекулы) становится доступным растворителю, что сопровождается гиперхромизмом.
Одно из применений УФ-спектроскопии - спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необходимость определения величин рК диссоциации протонов ионизуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке. Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации меняется спектр одного из хромофоров (например в случае тирозина). Рассмотрим гипотетический тирозинсодержащий белок и для определения числа внешних тирозиновых остатков воспользуемся правилом 2. Предположим, что в этом белке имеется пять тирозиновых остатков. Если все они расположены на поверхности и ионизуются при увеличении рН, спектр, отвечающий остаткам тирозина, будет приближаться к спектру свободного тирозина при высоких значениях рН, изображённому на рисунке 13. Другими словами зависимость D295 (lмакс для ионизованной формы) от рН будет выглядеть, как кривая А на рисунке 13. Когда же, наоборот, три тирозиновых остатка расположены внутри в неполярном окружении, полученная кривая аналогична кривой Б; отношение величины первого плато к конечной величине равно » 2/5. Отметим, что при очень высоких рН на кривой видно большое возрастание D295. Это указывает на то, что внутренние тирозиновые остатки стали доступны растворителю, т.е. белок развернулся (денатурировал). Если бы три внутренних тирозиновых остатка были в полярном окружении, то получили бы кривую, похожую на кривую В (рис.13), которая указывает, что эти три остатка имеют значение рК, отличное от такового для экспонированных групп.
 | Рис. 13 Кривые титрования тирозина, при построении которых использовали e295. Гипотетический белок содержит 5 тирозиновых остатков. А – все пять остатков находятся на поверхности, Б – два остатка на поверхности, а три внутри, в неполярном окружении, и, следовательно не титруются. В- три внутренних остатка находятся в полярном окружении и доступны растворителю. |
Список литературы
1. Свердлова О.В. Электронные спектры в органической химии. Л. Химия, 1973.
2. Иоффе Б.В., Костиков Р.Р., Разин В.В. Физические методы определения строения органических молекул. Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1976.
3. Вилков Л.В., Пентин Ю.А.Физические методы исследования в химии - Структурные методы и оптическая спектроскопия. М.: Высшая школа, 1987
4. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии. М.: Мир, 1980
5. Биополимеры./ под. ред. Ю.Иманиси М: Мир, 1988
6. Волькенштейн М.В. Биофизика. М: Наука, 1981