Курить вредно, дышать вредно, жить вредно

Заключение диссертации по теме "Биологические науки -- Генетика -- Молекулярная генетика -- Молекулярные основы изменчивости -- Молекулярные механизмы мутаций -- Репарации повреждений ДНК", Жарков, Дмитрий Олегович

6. Выводы

1. Проведены структурно-функциональные исследования эндонуклеазы VIII (Nei) из Е. coli:

• Методом рентгеноструктурного анализа (РСА) определены пространственные структуры фермента дикого типа и его мутантных форм с заменами критически важных аминокислотных остатков Glu2 и Arg252 в свободном состоянии и в ковалентном комплексе с ДНК, имитирующем интермедиат реакции, катализируемой этой эндонуклеазой.

• Показано, что при связывании поврежденной ДНК некоторые консервативные мотивы фермента изменяют конформацию и подвижность, а отдельные домены белка изменяют пространственную ориентацию, что приводит к сборке активного центра фермента.

• Установлено, что аминокислотные остатки Lys52, Asnl68 и Arg252 фиксируют остов ДНК в активном центре фермента, остатки Gln69, Leu70 и Туг71 обеспечивают выворачивание поврежденного звена в активный центр, остатки Prol и Glu2 участвуют в нуклеофильной атаке и протонированиидезоксирибозного цикла в ходе катализа, остатки Arg 173 и Gln261 обеспечивают корректное позиционирование цинкового пальца, а остаток Arg212 образует связи с поврежденным основанием.

• Показано, что активный центр Nei обладает достаточной пластичностью для частичной компенсации структурных изменений, образующихся при замене критически важных аминокислотных остатков.

• Методом «остановленной струи» с регистрацией флуоресценции остатков триптофана установлено, что каталитический акт с участием Nei включает как минимум пять стадий, сопровождающихся конформационными изменениями фермента. Три из них обратимы и отражают связывание ДНК и взаимную подгонку структур фермента и ДНК до каталитически компетентной конформации, одна необратимая стадия соответствует образованию и разрыву ковалентных связей в ходе реакции, и последняя, обратимая стадия связана с высвобождением продукта реакции.

2. Проведены структурно-функциональные исследования форМамидопиримидин-ДНК-гликозилазы (Fpg) из Е. coli:

• Методом РСА определена пространственная структура фермента в ковалентном комплексе с ДНК, имитирующем интермедиат реакции.

• Методом молекулярной динамики проведено компьютерное моделирование взаимодействий неповрежденных и поврежденных азотистых оснований (гуанин, 8-оксогуанин, 8-оксоаденин, 4,6-диаминопиримидин-5-илформамид, 2,4-диамино-6-оксо-1,6-дигидропиримидин-5-илформамид) в активном центре фермента, определены взаимодействия, важные для субстратной специфичности фермента.

• Установлено, что аминокислотные остатки Lys56, Asnl68 и Arg258 фиксируют остов ДНК в активном центре фермента, остатки Met73, Argl08 и PhellO обеспечивают выворачивание поврежденного звена в активный центр, остатки Prol и Glu2 участвуют в нуклеофильной атаке и протонировании дезоксирибозного цикла в ходе катализа, остатки His89, Arg 108 и Arg 109 обеспечивают изгиб ДНК, а остаток Lys217 образует связи с поврежденным основанием.

• Показано, что связывание ферментом Fpg поврежденной ДНК при низких температурах определяется энтропийным компонентом и сопровождается значительной дегидратацией поверхности взаимодействия, а при приближении к физиологическим температурам возрастает вклад энтальпийного компонента.

• Методом «остановленной струи» с регистрацией флуоресценции остатков триптофана и 2-аминопуриновой метки в ДНК установлено, что каталитический акт с участием Fpg включает как минимум семь стадий, сопровождающихся конформационными изменениями фермента. Пять из них обратимы и отражают связывание ДНК и взаимную подгонку структур фермента и ДНК до каталитически компетентной конформации, одна необратимая стадия соответствует образованию и разрыву ковалентных связей в ходе реакции, и последняя, обратимая стадия связана с высвобождением продукта реакции. Сравнение структуры фермента и данных предстационарной кинетики с различными субстратами и мутантными формами фермента позволило отнести эти стадии к неспецифичному связыванию ДНК, внедрению в ДНК интеркалирующего остатка PhellO, выворачиванию поврежденного звена ДНК в активный центр фермента, внедрению в ДНК интеркалирующих остатков Met73 и Arg 108 и изомеризации активного центра фермента.

3. Открыты ДНК-гликозилазы высших эукариот, гомологичные белкам Fpg и Nei -NEIL1, NEIL2, NEIL3. Определен механизм действия фермента NEIL1, показана его роль в предохранении клеток млекопитающих от повреждения ДНК, вызываемого ионизирующей радиацией. Проведен сравнительный анализ последовательностей и пространственных структур Fpg, Nei и их известных гомологов. По результатам анализа выделена группа Fpg/Nei как отдельное структурное суперсемейство ДНК-гликозилаз, отличное от известных суперсемейств эндонуклеазы III (Nth) и урацил-ДНК-гликозилазы, определены консервативные мотивы, ответственные за активность и субстратную специфичность этих ферментов.

4. Проведено исследование субстратной специфичности Fpg и Nei из Е. coli, NEIL1 и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы млекопитающих (OGG1).

• Показано, что в узнавании и превращении различных субстратов одним и тем же ферментом могут участвовать разные структурные элементы.

• Выделен мотив «головки считывания», важный для непрямого узнавания поврежденных оснований ДНК ферментами Fpg и Nei по вносимой ими в структуру ДНК нестабильности.

• Установлены и объяснены в рамках определенных структур ДНК-ферментных комплексов закономерности взаимодействия ферментов Fpg, OGG1 и NEIL1 с субстратами, содержащими кластерные повреждения.

5. Методом PC А установлена пространственная структура принадлежащего к суперсемейству Nth фермента эндонуклеазы V бактериофага Т4 в ковалентном комплексе с ДНК, имитирующем интермедиат реакции. На основании сравнения всех установленных структур ковалентных комплексов ДНК-гликозилаз и ДНК предложен механизм реакции Р-элиминации, катализируемой бифункциональными ДНК-гликозилазами суперсемейств Nth и Fpg/Nei.

6. Обнаружено ингибирование фермента OGG1 ионами Cd , которое может объяснять синергизм токсичности кадмия и окислительного стресса в клетках млекопитающих. Описано два пути ингибирования, один из которых связан с необратимой инактивацией фермента, а другой — с обратимым связываниемиона Cd2+ с ферментом или фермент-субстратным комплексом.

7. -Установлено, что цитоплазматическая фракция фермента OGG1 при мягком окислительном стрессе, вызванном голоданием, перераспределяется и преимущественно накапливается в клеточном ядре. Показано, что цитоплазматическая фракция OGG1, ДНК-гликозилазы NEIL2 и ДНК-полимеразы Р ассоциирована с микротрубочками.

5. Заключение

Настоящая работа представляет собой первое систематическое исследование, в результате которого был разработан комплексный подход к анализу активности и субстратной специфичности ключевых ферментов репарации — ДНК-гликозилаз, в целом применимый к любым ферментам. Подход объединяет исследование ферментов с помощью метода рентгеноструктурного анализа (РСА), компьютерное моделирование и сравнение физико-химических свойств аминокислотных остатков в группах белковых последовательностей для формирования представлений о возможных функциях отдельных аминокислотных остатков в данных белках, и сайт-направленный мутагенез, изучение термодинамики и кинетики взаимодействия ферментов с субстратами разной степени специфичности в стационарном и предстационарном режиме для экспериментальной проверки выдвинутых предположений. Использование такого подхода позволило изучить функции нескольких ДНК-гликозилаз бактериальной и эукариотической природы на уровнях от субмолекулярного до клеточного.

Методы структурного анализа высокого разрешения (РСА, ЯМР) в наши дни активно применяются не просто для установления структур белков, но и для исследования механизмов их функционирования, для чего необходимо определение структур белка в разных функциональных состояниях (например, комплексов фермента с разными типами субстратов, продуктов и ингибиторов) и определение структур близко родственных белков. В настоящей работе была впервые определена структура эндонуклеазы VIII из Е. coli (Nei) как в свободном виде, так и в комплексе с ДНК, структура формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы из Е. coli (Fpg) в комплексе с ДНК и структура эндонуклеазы V бактериофага Т4 (DenV) в ковалентном комплексе с ДНК. Таким образом была закончена структурная характеризация представителей всех главных семейств ДНК-гликозилаз. Наилучшим образом со структурной точки зрения был охарактеризован белок Nei, что позволило выявить конформационные изменения, происходящие при связывании им ДНК. Было также выявлено важное свойство — пластичность его активного центра, частично компенсирующая замены критических аминокислотных остатков. В целом структуры Fpg и Nei обнаруживают новый тип укладки ДНК-связывающих белков, в котором решающая роль в связывании ДНК принадлежит немногочисленным гибким петлям, фиксированным на более жестких элементах структуры (ß-сэндвич, мотив «спираль—два поворота—спираль», цинковый палец), которые разнесены по двум доменам белка и могут собираться вместе при связывании субстрата. Это делает структурную организацию Fpg и Nei потенциально полезной для инженерии ДНК-зависимьгх ферментов с новыми субстратными специфичностями.

Комбинация структурных, вычислительных и биохимических методов позволила в настоящей работе предложить механизм узнавания поврежденных оснований ферментами Fpg и Nei, который, вполне вероятно, может функционировать также в других ДНК-гликозилазах и в ферментах других классов. Согласно этому механизму, узнавание поврежденного звена начинается с того, что фермент вносит искажение в конформацию ДНК; в структуре Fpg обнаружен «седловой мотив», который идеально подходит для этой роли. По-видимому, неповрежденная ДНК достаточно устойчива к такой деформации, а поврежденная менее стабильна и может изламываться в точке повреждения. Затем следуют несколько последовательных шагов, сопровождающихся конформационными изменениями фермент-субстратного комплекса, в ходе которых аминокислотные остатки фермента внедряются в ДНК, а поврежденное звено выворачивается в активный центр фермента. На каждой из этих стадий в принципе возможна дискриминация ферментом поврежденных и неповрежденных оснований с тем, чтобы максимально облегчить попадание в активный центр поврежденных оснований и максимально затруднить это для неповрежденных. Наконец, окончательное узнавание ферментом поврежденного основания в ДНК происходит при образовании в активном центре наборов контактов, причем, по-видимому, ДНК-гликозилазы с достаточно широкой субстратной специфичностью могут образовывать несколько разных наборов контактов, обеспечивающих эффективное вьпцепление разных оснований. Подобные многоступенчатые механизмы могут в принципе использоваться для предотвращения процессинга неправильных субстратов в случае, когда цена ошибки достаточно высока (например, сходные механизм селекции субстрата действуют у сериновых протеаз и ДНК-полимераз).

В ходе работы открыта новая группа эукариотических ферментов, гомологичных Fpg и Nei. Активности этих ферментов (NEIL1-NEIL3) могут расширять спектр субстратов, репарируемых в клетках млекопитающих по механизму эксцизионной репарации оснований (ЭРО). Например, фермент NEIL1 удаляет из ДНК некоторые стереоизомеры тимингликоля, которые не выщепляются другими ферментами репарации окисленных пиримидинов. Кроме того, он может принимать участие в репарации поврежденных оснований, соседствующих с разрывами в составе кластерных повреждений ДНК. Эти активности важны для снижения повреждающего действия ионизирующего излучения; вполне вероятно, что и другие ферменты NEIL обладают уникальными свойствами, обеспечивающими им место в процессе ЭРО.

Проведены исследования одной из важнейших ДНК-гликозилаз млекопитающих, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (СЮ01). Помимо изучения механизмов узнавания ею субстратов, в том числе кластерных повреждений, в настоящей работе показано, что ее инактивация может вносить вклад в генотоксичноедействие ионов С<12+. Еще более интересным оказалось то, что цитоплазматическая фракция 0001 по крайней мере частично связана с микротрубочками и может быстро перемещаться в ядро при генотоксическом стрессе. Помимо 0001, была показана ассоциация с микротрубочками ДНК-гликозилазы ЫЕ1Ы и ключевого фермента ЭРО — ДНК-полимеразы р. Возможно, что именно с участием микротрубочек может при необходимости происходить динамическое перераспределение и быстрая мобилизация цитоплазматических резервов ферментов репарации.

Проведенная экспериментальная работа позволила достаточно подробно ответить на вопросы, стимулировавшие постановку цели и определившие список задач исследования. В работе получены данные, не имеющие аналогий в мировой литературе. Список публикаций, в которых представлены результаты работы, приведен в Приложении 3. Однако достигнутые цели позволили сформулировать несколько новых перспективных направлений исследований. В частности, как показали результаты опытов с ферментом Fpg, очень перспективно исследование структурной динамики ДНК-гликозилаз при направленном введении флуоресцентных меток в разные части фермента или субстрата, в особенности в сочетании с компьютерным моделированием разных этапов процесса узнавания субстрата. Весьма интересным является вопрос о влиянии разнообразных факторов — внутриклеточных условий, других ферментов ЭРО, встречающихся в природе полиморфизмов — на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз. Очень слабо исследован на текущий момент процесс поиска поврежденных звеньев ДНК-гликозилазами, и их взаимодействия с неповрежденной ДНК нуждаются в углубленном изучении. Наконец, практически не изучены взаимодействия ДНК-гликозилаз с компонентами клетки, не относящимися к системе ЭРО. О возможности неожиданных находок в этой области, помимо наших результатов, говорит хотя бы тот факт, что при протеомном изучении взаимодействий ДНК-гликозилаз было обнаружено связывание 0001 сбелками процессинга мРНК — комплексами кэппинга и полиаденилирования. Можно с уверенностью утверждать, что изучение различных аспектов функционирования ДНК-гликозилаз будет в ближайшие годы чрезвычайно актуально.

Лауреатами Нобелевской премии по химии 2015 года Ими стали Томас Линдаль, Пол Модрич и американец Азиз Санджар. Нобелевский комитет отметил вклад этих ученых в исследование механизмов восстановления (репарации) ДНК — важной внутриклеточной системы, нацеленной на поиск и исправление многочисленных повреждений, возникающих при нормальной репликации ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических агентов. Нарушение работы этой системы связано с целым рядом тяжелых наследственных болезней, да и вообще, без нее сложные формы жизни вряд ли бы могли существовать.

Говорят, что каждая минута приближает нас к смерти. С точки зрения биохимика это не просто тривиальная фраза. ДНК всех живых организмов постоянно подвергается воздействию повреждающих факторов. Какие-то из них приходят извне — тот же ультрафиолет, радиация, тысячи химически активных веществ в нашей пище.

Но гораздо важнее факторы внутренние, которых мы не можем избежать в принципе. Главных таких факторов три. Во-первых, весь наш обмен веществ основан на кислородном дыхании. Митохондрии — клеточные органеллы, в которых кислород используется для производства АТФ, «энергетической валюты» наших клеток, — работают не с абсолютной эффективностью, и промежуточные активные формы кислорода утекают из них и способны повреждать ДНК. Во-вторых, как известно, мы в среднем на 60% состоим из воды, которая, в общем, тоже очень активное соединение и постоянно гидролизует ДНК. Наконец, еще одним важным источником повреждений в ДНК служат ошибки ферментов, которые ее копируют, — ДНК-полимераз; количество неверно включенных нуклеотидов составляет около 300 000 на каждое клеточное деление.

Наглядно представить себе масштаб проблемы позволяет несложный пересчет. Если вообразить ДНК одной человеческой клетки в виде Транссибирской магистрали и свести вместе оценочные величины для всех известных видов повреждений, то получится, что количество повреждений, возникающих каждый день в ДНК каждой клетки человека, соответствует одной поломке на каждые 100 метров Транссиба. Не каждый организм был бы способен выжить при такой нагрузке.

В том, что мы до сих пор живы, заслуга репарации ДНК. Насчитывается шесть основных ее механизмов.

Известны три гена, которые отвечали за темновую репарацию, их назвали uvrA, uvrB и uvrC (uvr — от английского «UV-resistant», устойчивый к ультрафиолету).

Санджар, занявшись этим вопросом, для начала изобрел совершенно фантастический метод бактериальных «макси-клеток», который позволял получать огромный избыток нужного продукта при минимальном загрязнении другими клеточными белками. На рубеже 1970–80-х годов им пользовались десятки лабораторий для идентификации самых разных белков, а сам изобретатель с его помощью быстро охарактеризовал белковые продукты геновuvrA, uvrB и uvrC и показал, что они образуют комплекс, который назвалиэксцинуклеазой (Excinuclease) — он был способен вырезать (англ. excise) кусок ДНК размером 13 пар нуклеотидов вокруг тиминового димера. От этого весь механизм получил название эксцизионной репарации нуклеотидов (Nucleotide excision repair, NER; рис. 2). Дальнейшие исследования позволили установить, что после вырезания фрагмента, содержащего повреждение, ДНК-полимераза синтезирует нормальный участок цепи ДНК, и процесс репарации завершается ферментом ДНК-лигазой, которая восстанавливает целостность остова ДНК.

Рис. 2. Эксцизионная репарация нуклеотидов. Эксцинуклеаза UvrABC вырезает короткий участок ДНК вокруг повреждения, геликаза UvrD его вытесняет, и образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой

Как выяснилось впоследствии, эксцизионная репарация нуклеотидов для жизни в целом гораздо важнее, чем фотореактивация. Например, у человека фотолиазы нет — из всех млекопитающих ее сохранили только сумчатые, а у остальных сохранились гомологи фотолиазы, криптохромы, отвечающие за суточные ритмы (и тоже открытые Санджаром). Поэтому вся репарация вызванных ультрафиолетовым светом повреждений у нас опирается исключительно на эксцизионную репарацию нуклеотидов. Правда, белки этой системы у нас совсем не похожи на бактериальные, но принцип работы тот же — вырезать отрезок ДНК и заменить его новым. Дефекты эксцизионной репарации нуклеотидов вызывают тяжелейшее наследственное заболевание —пигментную ксеродерму, при которой малейшее пребывание на солнце приводит к ожогам, и за несколько лет жизни развивается рак кожи. Да что там кожи: для пигментной ксеродермы очень характерен рак кончика языка — человек на свету облизывает пересохшие губы, и этих нескольких секунд облучения достаточно, чтобы в ДНК возникло столько повреждений, что они в отсутствие репарации вызывают мутации и рак. Еще более важно то, что фотореактивация — процесс специфичный только для тиминовых димеров, другие повреждения ею не исправляются, а вот эксцизионная репарация нуклеотидов универсальна и помогает бороться с огромным числом самых разнообразных повреждений ДНК, например с теми, что вызываются канцерогенами в табачном дыме.

ЭксцизионнАЯ репарация исправляет 10% всех повреждений, возникающих в нашей ДНК.

Эксцизионная репарация

зависимый процесс, в котором участвуют ферменты UvrA,UvrB,UvrC. Эту систему ещё часто называютUvrABC-эндонуклеазой.

Стадии репарации:

1.Ферментный комплексUvrABCразрезает цепь ДНК у7-гои3-го/4-гонуклеотида с 5’- и 3’- стороны от повреждения, соответственно.

2.Вырезанный11-12нуклеотидный фрагмент затем вытесняется фермен-

том UvrD(хеликаза II).

3.ДНК-полимеразаIсин-

тезует комплементарную цепочку, аДНК-лигазасшивает цепи.

Уэукариот NER-системасостоит из 16 белков и вырезает отрезок длиной примерно 30 нуклеотидов.

Рис. 70. Механизм NER-репарации

В ходе репликации ДНК-полимеразаможет совершать ошибки. Неспаренные нуклеотиды удаляются с помощью мисметч репарации (англ.mismatch — несовпадение).MMR-системаспособна исправить инсерции и делеции до 4 нуклеотидов. ВажностьMMR-репарацииподчеркивается тем фактом, что у людей с наследственными дефектами этой системы наблюдается повышенная предрасположенность к раковым заболеваниям. Стадии репарации у кишечной палочкиE. coli:

1.Белок MutSсвязывается с некомплементарной парой нуклеотидов.

2.К MutS присоединяется белок MutL.

3.Комплекс MutS2-MutL2транслорцируется вдоль цепи ДНК таким образом, что формируется петля, замыкающаяся на ком-

плекс MutS2-MutL2.

4.При движении по цепи ДНК комплекс MutS2-MutL2распознает неметилированную цепочку нуклеотидов GATC и связывается с белкомMutH(эндонуклеаза).

5.MutHактивируется и разрезает цепь с5’-концау неметилированной цепочки GATC (так система распознает новосинтезированную дочернюю цепь ДНК — после синтеза она лишь частично метилирована, а материнская цепь метилирована полностью). Такая неметилированная последовательность GATC мо-

жет находиться и в 1000 нуклеотидных остатках от сайта повреждения.

6.Хеликаза UvrD(из NERсистемы) разрывает водородные связи между родительской и дочерней цепями.

7.Экзонуклеазаполностью расщепляет дефектный участок ДНК.

8.ДНК-полимеразаIIIсинтези-

рует участок дочерней цепи, комплементарный родительской ДНК.

Учеловека нет гомологов белка MutH, поэтому используется другой механизм распознавания дочерней цепи. По одной из теорий, дочерняя цепь определяется по разрывам между фрагментами Оказаки.

Днунитевые разрывы в ДНК появляются из-завоздействия ионизирующей радиации или свободных радикалов (продуктов окислительного метаболизма). Нерепарированные двунитевые разрывы могут стать летальными для клетки или спровоцировать рак. Существует два основых механизма репарации двунитевых разрывов:

1.Рекомбинационная репарация;

2.Негомологичное соединение концов.

	Негомологичное соединение концов	Рис. 71. Механизм MMR-
	ДНК при двунитевых разрывах требует
	репарации
	отщепления нескольких нуклеотидов,
	поэтому часто тоже провоцирует мута-

ции, но они не так опасны для клетки, как нерепарированные двунитевые

разрывы. В этом виде репарации участвуют белки Ku(димерKu70+Ku80). Они присоединяются к ДНК в области малой и большой бороздок и отщепляют несколько нуклеотидных остатков. Затем происходит сшивание цепей. К70-игодам в соматических клетках человека скапливается до 2000 подобных «шрамов» от негомологичного соединения цепей ДНК.

Агенты, повреждающие ДНК, индуцируют комплексную систему защиты в клетках кишечной палочки E. coli —SOS-ответ.Эта система регулируется белкамиLexA(репрессор) иRecA(ДНК-связывающийбелок). В норме LexA подавляет экспрессию гена SOS. Однако при повреждении цепи ДНК связываются с RecA и формируют комплекс, который выключает LexA.SOS-системаконтролируется 43 генами, среди которых — гены, кодирующиеДНК-полимеразы IVиV. Эти полимеразы способны синтезировать цепь, не имея матрицы в виде комплементарного участка ДНК. ПоэтомуSOS-репарациясовершает ошибки и является мутагенной, однако позволяет продлить срок жизни клетки. По мнению некоторых учёных, эта система позволяет клеткам приобрести новые признаки, утратив при этомкакие-либодругие.

Рекомбинационная репарация у кишечной палочки осуществляется следующим образом:

1.Репликативная вилка встречает одноцепочечный разрыв и останавливается.

2.Процесс восстановления начинается с переноса белкамиRecBCD+RecAучастка новосинтезированной и неповрежденной ДНК на двуцепочечную ДНК в место повреждения (с 3’- конца).

3.Образуется структура Холлидея. Происходит обмен3’-концамимежду репликативными вилками с помощью белковRuvAB.

4.Белок RuvCразрывает структуру Холлидея и восстанавливает репликативные вилки.

5.Процесс репликации продолжается при участии особой прай-

мосомы.

y

Как всё начиналось

Когда закончилась Вторая мировая война, люди разных профессий по-разному подводили ее итоги. Политики перекраивали карту мира, генералы — перестраивали тактику и стратегию с новыми видами оружия... Были свои итоги и у врачей. Война показала волшебную силу лекарств нового типа — антибиотиков, которые, начиная с 1944 года, спасли жизнь десяткам тысяч раненых.

Поэтому вскоре после окончания войны молодой микробиолог Альберт Кельнер, работавший в лаборатории Колд-Спринг-Харбор, тогда еще не ставшей Меккой молекулярной биологии, занялся модной в то время темой, сулящей при удаче большой коммерческий успех, — поиском мутантных форм бактерий и микроскопических грибков, которые могли бы производить новые антибиотики или хотя бы большие количества уже известных антибиотиков. Кельнер решил облучать культуры стрептомицетов ультрафиолетовым светом, мутагенные свойства которого были известны уже тогда. Но дела не заладились с самого начала: эксперименты плохо воспроизводились. Одни облученные культуры росли хорошо, другие плохо, и закономерности в этом не наблюдалось никакой.

Если бы Альберт Кельнер был не таким аккуратным ученым и не записывал все детали своих экспериментов, возможно, он забросил бы свой проект, и Нобелевская премия по химии 2015 года была бы вручена за совершенно другие работы. Однако, тщательно проанализировав всё, что могло пойти не так, Кельнер сделал верный вывод. После облучения он растил культуры бактерий в стеклянных колбах, погруженных в стеклянную же водяную баню. В тех колбах, которые были обращены в сторону окна, бактерии выживали после ультрафиолета лучше, а в тех, которые были затенены, — хуже.

Кельнер догадался, что солнечный свет каким-то образом запускает в бактериях процесс, который помогает им исправить повреждения, нанесенные ультрафиолетом. Это явление вскоре назвали фотореактивацией, и она стала первым известным биологам видом репарации ДНК. Один из нынешних лауреатов, Азиз Санджар, в свои аспирантские годы поставил очень эффектный эксперимент, показывающий всю мощь системы фотореактивации: он облучал бактерии на чашках Петри ультрафиолетом в смертельной дозе, так, что выживало менее одной клетки из 10 миллионов, а потом светил на них фотовспышкой. Света продолжительностью 1 миллисекунду хватало, чтобы число выживших бактерий увеличилось в сто тысяч раз!

Увы, до наших дней Альберт Кельнер не дожил и даже не получил заслуженной известности — в наше время достаточно сказать, что статьи о нем нет в Википедии. Независимо от Кельнера и буквально на несколько недель позже фотореактивацию обнаружил Ренатто Дульбекко — знаменитый итальянско-американский вирусолог, который позже получил Нобелевскую премию, но не за открытие репарации, а за работы с онковирусами. Интересно, что Кельнер написал Дульбекко о своем открытии, но тот получил письмо как раз тогда, когда заканчивал опыты по выживанию облученных ультрафиолетом бактериофагов — с теми же результатами и выводами, что и у Кельнера.

Именно поэтому формулировка нынешней премии — «за исследование механизмов репарации ДНК», а не «за открытие репарации ДНК». Первооткрывателей в живых не осталось, да и вообще в этой области не было фигур, про которых можно было бы сказать, что они ее заложили. Лауреаты 2015 года внесли огромный вклад в изучение репарации ДНК, но наряду с ними работали и другие, не менее великие ученые. Среди исследователей, занимающихся репарацией ДНК, даже бытовало мнение, что Нобелевской премии за нее не дадут — настолько трудно выбрать лауреатов среди многих достойных.

Но прежде чем говорить об исследованиях Томаса Линдаля, Пола Модрича и Азиза Санджара, стоит сказать несколько слов о репарации ДНК в целом. На самом деле, это даже не один механизм, а как минимум шесть разных — а в зависимости от того, что принимать за репарацию, можно насчитать и восемь.

Курить вредно, дышать вредно, жить вредно

Говорят, что каждая минута приближает нас к смерти. С точки зрения биохимика это не просто тривиальная фраза. ДНК всех живых организмов постоянно подвергается воздействию повреждающих факторов. Какие-то из них приходят извне — тот же ультрафиолет, радиация, тысячи химически активных веществ в нашей пище (знаете ли вы, что чашка кофе содержит несколько сотен соединений, которые в больших дозах мутагенны?).

Но гораздо важнее факторы внутренние, которых мы не можем избежать в принципе. Главных таких факторов три. Во-первых, весь наш обмен веществ основан на кислородном дыхании. Митохондрии — клеточные органеллы, в которых кислород используется для производства АТФ, «энергетической валюты» наших клеток, — работают не с абсолютной эффективностью, и промежуточные активные формы кислорода утекают из них и способны повреждать ДНК. Во-вторых, как известно, мы в среднем на 60% состоим из воды, которая, в общем, тоже очень активное соединение и постоянно гидролизует ДНК. Наконец, еще одним важным источником повреждений в ДНК служат ошибки ферментов, которые ее копируют, — ДНК-полимераз; количество неверно включенных нуклеотидов составляет около 300 000 на каждое клеточное деление.

Наглядно представить себе масштаб проблемы позволяет несложный пересчет. Если вообразить ДНК одной человеческой клетки в виде Транссибирской магистрали и свести вместе оценочные величины для всех известных видов повреждений, то получится, что количество повреждений, возникающих каждый день в ДНК каждой клетки человека, соответствует одной поломке на каждые 100 метров Транссиба. Не каждый организм был бы способен выжить при такой нагрузке.

В том, что мы до сих пор живы, заслуга репарации ДНК. Как уже говорилось, насчитывается шесть основных ее механизмов, и к четырем из них нынешние лауреаты имеют непосредственное отношение.