Раздел 6. обмен простых белков и аминокислот
РАБОТА 13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МОЧЕВИНЫ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ ДИАЦЕТИЛМОНООКСИМОВЫМ МЕТОДОМ
Цель работы: ознакомиться с одним из методов определения концентрации мочевины в крови и моче, который широко используется в диагностике для оценки тяжести патологического процесса, для наблюдения за течением заболевания и оценки эффективности проводимого лечения, а также оценки состояния выделительной функции почек.
Задачи:
Ÿ определить концентрацию мочевины в сыворотке крови и моче и сделать выводы.
Мочевина является одним из основных конечных продуктов белкового обмена. Азот мочевины составляет около 50% остаточного азота крови. Количество мочевины в сыворотке крови в норме составляет 2,49-8,33 ммоль/л (20-50 мг/дл).
Содержание мочевины в крови возрастает при любых патологических состояниях. Однако наиболее важное диагностическое значение имеет увеличение количества мочевины при заболеваниях почек (в 2-10 раз). Уменьшение количества мочевины в крови наблюдается при болезнях печени (цирроз, гепатиты).
Количество мочевины, выделяемое из организма, свидетельствует об интенсивности белкового обмена. При употреблении пищи, богатой белками, а также при усиленной мышечной работе содержание мочевины в моче увеличивается, а при безбелковой диете – снижается. Количество мочевины в суточной моче подвержено возрастным изменениям и составляет:
у новорожденных – следы;
1-3-месячных – 0,7-1,4 г/сутки;
4-6-месячных – 1,0-3,3 г/сутки;
7-9-месячных – 3,8-5,7 г/сутки;
2-5-летних – 5-11 г/сутки;
14-летних – 20 г/cутки;
у взрослых – 20-35 г/сутки (333-582 ммоль/сутки).
Определение количества мочевины в моче представляет клинический интерес. Увеличение содержания мочевины наблюдается при лихорадочных состояниях, сахарном диабете. Количество мочевины в моче резко снижается при почечной недостаточности, патологиях печени (цирроз, дистрофия, гепатиты), а также при общем и белковом голодании.
Принцип метода. Мочевина взаимодействует с диацетилмоноокси-мом в присутствии тиосемикарбазида и трёхвалентного железа в кислой среде при нагревании с образованием комплексного соедине-ния розово-красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины.
1. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови
Ход работы. В три пробирки вносят автоматической пипеткой:
1) в опытную – 0,01 мл свежей негемолизированной сыворотки крови,
2) в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора мочевины,
3) в контрольную – 0,01 мл дистиллированной воды.
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента и содержимое перемешивают. Пробирки накрывают кусочками фольги, помещают в бурно кипящую водяную баню на 10 минут, после чего охлаждают под струёй проточной воды. Затем опыт и стандарт колориметрируют против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм). Окраска растворов стабильна около 15 минут после снятия проб из бани.
Результаты: количество мочевины в сыворотке крови рассчитывают по формуле:
С = (Еоп × Сст) / Ест,
где С – количество мочевины в сыворотке крови (ммоль/л);
Сст – концентрация стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л);
Еоп – оптическая плотность опытной пробы;
Ест – оптическая плотность стандартной пробы.
2. Определение концентрации мочевины в моче
Ход работы. Мочу перед анализом разбавляют дистиллированной водой в 25 раз (к 1 мл мочи добавляют 24 мл Н2О). В три пробирки вносят автоматической пипеткой:
1) в опытную – 0,01 мл разведенной мочи,
2) в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л),
3) в контрольную – 0,01 мл дистиллированной воды.
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, перемешивают, накрывают кусочками фольги и помещают в бурно кипящую водяную баню на 10 минут. После кипячения пробы охлаждают под струёй проточной воды и колориметрируют (опыт и стандарт) против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм).
Окраска растворов стабильна в течение 15 минут после снятия проб из бани.
Результаты: количество мочевины в моче рассчитывают по формуле:
С = (Еоп × Сст × А × 1,5) / Ест,
где С – количество мочевины в суточной моче (ммоль/сутки);
Сст – концентрация стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л);
Еоп – оптическая плотность опытной пробы;
Ест – оптическая плотность стандартной пробы;
А – разведение мочи;
1,5 – коэффициент пересчёта на среднесуточное количество мочи (у мужчин – 1,5 л, женщин – 1,2 л).
Выводы:
Техника безопасности:
Ø Будьте внимательны при отмеривании рабочего реагента.
Ø Соблюдайте правила техники безопасности, пользуясь кипя-щей водяной баней.