Поняття та основа реплікації
Реплікація (позднелат. replicatio - повторення, від лат. Replico - звертаюся тому, повторюю), редуплікація, ауторепродукція, аутосінтез, що протікає у всіх живих клітинах процес самовідтворення (самокопірованія) нуклеїнових кислот, генів, хромосом.
Реплікація ДНК - це процес синтезу дочірньої молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти, який відбувається в процесі поділу клітини на матриці батьківської молекули ДНК. При цьому генетичний матеріал, зашифрований у ДНК, подвоюється і ділиться між дочірніми клітинами. Реплікацію ДНК здійснює фермент ДНК-полімераза.
В основі механізму реплікація лежить ферментативний синтез дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або рибонуклеїнових кислот (РНК), здійснюваний за матричним принципом. Запропонована в 1953 Дж. Уотсоном і Ф. Криком модель будови ДНК - так звана подвійна спіраль - з одного боку, пояснила, яким чином записана генетична інформація в молекулі ДНК, з іншого - дозволила зрозуміти і експериментально вивчати хімічні механізми подвоєння генетичного матеріалу. Сувора специфічність спарювання азотистих основ у молекулі ДНК обумовлює комплементарність послідовностей підстав у двох ланцюгах і забезпечує високу точність Реплікація Пара гуанін - цитозин стабілізується трьома водневими зв'язками, пара аденін - тимін - двома, що різко знижує імовірність неправильного спарювання підстав. Згідно Уотсону і Крику, процес Реплікація ДНК передбачає: 1) розрив водневих зв'язків і розплітання ниток подвійної спіралі, 2) синтез на одиночних нитках комплементарних ланцюгів. У результаті з однієї дволанцюжкової ДНК виникають дві подібні молекули, причому в кожній з дочірніх молекул одна полинуклеотидная ланцюг батьківська, а інша - синтезована заново (напівконсервативному механізм Реплікація).
У вірусів і фагів, що мають однониткову ДНК, Реплікація йде особливим чином. Після впровадження в клітку господаря одноланцюжковою ДНК, яку називають (+)-ланцюгом, на ній, як на матриці, синтезується комплементарна їй (-)-ланцюг. На утворилася двухспіральной молекулі (репликативная форма) синтезуються нові одноланцюгові (+)-ланцюга, що включаються в нові вірусні частки. За таким же принципом відбувається Реплікація РНК-вмісних вірусів і фагів. Т. о., У всіх відомих випадках Реплікація ДНК і РНК проходить через стадію дволанцюжкові молекул [1, 23-25].
У вищих організмів - еукаріотів, клітини яких містять сформоване ядро, основну генетичну функцію несуть складно організовані структури - хромосоми, що складаються з ДНК, РНК, білків і інших речовин. У інтерфазі, що передує поділу клітин (див. Мітоз, Мейоз), здійснюється Реплікація ДНК і інших компонентів хромосом; потім подвоєні хромосоми роз'єднуються і розподіляються рівномірно між дочірніми клітинами. Т. о., Вся спадкова інформація у відносно незмінному вигляді передається від клітини до клітини, від покоління до покоління.
Геліказа, топоізомераза і ДНК-зв'язуючі білки розплітають ДНК, утримують матрицю в розведеному стані і обертають молекулу ДНК. Правильність реплікації забезпечується точним відповідністю комплементарних пар основ і активністю ДНК-полімерази, здатної розпізнати і виправити помилку. Реплікація у еукаріотів здійснюється кількома різними ДНК-полімеразами. Далі відбувається закручування синтезованих молекул за принципом суперспіралізацію і подальшої компактизації ДНК. Синтез енерговитратний.
Ланцюги молекули ДНК розходяться, утворюючи репликационной вилку, і кожна з них стає матрицею, на якій синтезується нова комплементарна ланцюг. У результаті утворюються дві нові двоспіральні молекули ДНК, ідентичні батьківського молекулі.
Кожна молекула ДНК складається з одного ланцюга початкової батьківської молекули і однієї знову синтезованої ланцюга. Такий механізм реплікації називається напівконсервативним. В даний час цей механізм вважається доведеним завдяки дослідам Метью Мезельсона і Франкліна Сталя (1958 р.). Раніше існували і дві інші моделі: «консервативна» - в результаті реплікації одна молекула ДНК складається тільки з батьківських ланцюгів, а інша - тільки з дочірніх ланцюгів; «дисперсійна» - всі отримані в результаті реплікації молекули ДНК складаються з ланцюгів, одні ділянки яких знову синтезовані, а інші взяті з батьківської молекули ДНК)[1, 56].
Процес редуплікації: розкручування спіралі молекули - відділення одного ланцюга від одної на частини молекули ДНК - вплив ферменту ДНК-полімерази на молекулу - приєднання до кожного ланцюга ДНК комплементарних нуклеотидів - утворення двох молекул ДНК з однієї.
Процес реплікації ДНК
У процесі реплікації подвійна спіраль ДНК, що складається з двох комплементарних полінуклеотидних ланцюгів, розкручується на окремі ланцюги і одночасно починається синтез нових полінуклеотидних ланцюгів; при цьому вихідні ланцюга ДНК грають роль матриць. Нова ланцюг, синтезуються на кожній з вихідних ланцюгів, ідентична ін вихідної ланцюга. Коли процес завершується, утворюються дві ідентичні подвійні спіралі, кожна з яких брало складається з однієї старої (вихідної) і однієї нової ланцюга. Таким чином від одного покоління до іншого передається тільки одна з двох ланцюгів, складових вихідну молекулу ДНК, - так званий напівконсервативному механізм реплікації.
Реплікація складається з великої кількості послідовних етапів, які включають впізнавання точки початку реплікації, розплітання вихідного дуплексу (спіралі), утримання його ланцюгів в ізольованому один від одного стані, ініціацію синтезу на них нових дочірніх ланцюгів, їх зростання (елонгацію), закручування ланцюгів в спіраль і терминацию (закінчення) синтезу. Всі ці етапи реплікації, що протікають з високою швидкістю і винятковою точністю, забезпечує комплекс, що складається більш ніж з 20 ферментів і білків, - так звана ДНК-репліказная система, або бактерій реплісомою. Функціональна одиниця реплікації - реплікону, що представляє собою сегмент (ділянка) хромосоми або позахромосомних ДНК, обмежений точкою початку, в якій ініціюється реплікація, і точкою закінчення, в якій реплікація зупиняється. Швидкість реплікації контролюється на стадії ініціації. Одного разу почавшись, реплікація продовжується до тих пір, поки весь реплікону не буде дуплицировать (подвоєний). Частота ініціації визначається взаємодія спеціальних регуляторних білків з точкою початку реплікації. Бактеріальні хромосоми містять один реплікону: ініціації в єдиній точці початку реплікації веде до реплікації всього геному. У кожному клітинному циклі реплікація ініціюється лише один раз. Плазміди і віруси, які є автономними генетичними елементами, представляють собою окремі реплікону, здатні до багаторазового ініціації в клітині - хазяїні. Еукаріотічние хромосоми (хромосоми всіх організмів, за винятком бактерій і синьо-зелених водоростей) містять велику кількість реплікону, кожен з яких також одноразово ініціюється за один клітинний цикл [2,141-142].
Починаючи з точки ініціації, реплікація здійснюється в обмеженій зоні, що переміщається уздовж вихідної спіралі ДНК. Ця активна зона реплікації (т.зв. реплікац. вилка) може рухатися в обох напрямах. При односпрямованої реплікації вздовж ДНК рухається одна репликационная вилка. При двобічної реплікації від точки ініціації в протилежних напрямках розходяться дві реплікаційний вилки; швидкості їх руху можуть різнитися. При реплікації ДНК бактерії і ссавців швидкість росту дочірньої ланцюга становить соотв. 500 і 50 нуклеотидів в 1 с; у рослин ця величина не перевищує 20 нуклеотидів в 1 с. Рух двох вилок в протилежних напрямах створює петлю, яка має вигляд "бульбашки" або "очі". Триваюча реплікація розширює "око" до тих пір, поки він не включить у себе весь реплікону.
У ході реплікації зростання ланцюга здійснюється завдяки взаємодії дезоксирибонуклеозидтрифосфата з 3'-ОН кінцевим нуклеотидом вже побудованої частини ДНК, при цьому відщеплюється пірофосфат і утворюється фосфодіефірних зв'язок. Зростання полинуклеотидной ланцюга йде тільки з її З "-кінця, тобто в напрямку 5 ': 3'. Фермент, що каталізує цю реакцію,-ДНК - полімераза. Енергія, що витрачається на освіту кожної нової фосфодіефірних зв'язку в ланцюгу ДНК, забезпечується розщепленням фосфатної зв'язку між a-і b-фосфатними групами нуклеозидтрифосфат.
ДНК-полімераза має один центр зв'язування нуклеозидтрифосфат, загальний для всіх чотирьох нуклеотидів. Вибір з-поміж нуклеотиду, заснування якого комплементарно чергового підставі матриці, протікає без помилок, завдяки визначає впливу ДНК-матриці (вихідної ланцюга ДНК). При деяких мутаційних пошкодженнях структури ДНК-полімерази в ряді випадків відбувається включення некомплементарних нуклеотидів.
У процесі реплікації формальної ДНК на короткий час з імовірністю 10-4-10-5 виникають рідкісні таутомерних форм всіх 4 азотистих основ нуклеотидів, які утворюють неправильні пари. Висока точність реплікації (імовірність помилок не перевищує 10-9) зумовлена наявністю механізмів, які здійснюють корекцію (репарацію).
Репликационная вилка асиметрична. З двох синтезованих дочірніх ланцюгів ДНК одна будується безперервно, а інша - з перервами. Першу називають ведучої, чи лідируючої, ланцюгом, а другу - відстає. Синтез другий ланцюга йде повільніше; хоча в цілому цей ланцюг будується в напрямку 3 ': 5', кожен з її фрагментів окремо нарощується у напрямку 5 ': 3'. Завдяки такому переривчастих механізму синтезу, реплікація обох антипаралельних ланцюгів здійснюється за участю одного ферменту-ДНК-полімерази, що каталізує нарощування нуклеотидної ланцюга тільки в напрямку 5 ': 3'.
Щоб забезпечити утворення безперервного ланцюга ДНК з багатьох таких фрагментів, в дію вступає особлива система репарації ДНК, що видаляє РНК-затравки і замінює її на ДНК. У бактерій РНК-затравка видаляється нуклеотид за нуклеотидом завдяки 5 ': 3'-екзонуклеазну активності ДНК-полімерази. При цьому кожен відщепленим рібонуклеотідний мономер заміщається відповідним дезоксирибонуклеотидів (як приманка використовується З "-кінець синтезованого на старій ланцюга фрагмента). Завершує весь процес фермент ДНК-лігаза, що каталізує утворення фосфодіефірних зв'язку між групою З "-ОН нового фрагмента ДНК і 5-фосфатною групою попереднього фрагмента. Освіта зв'язку з цим вимагає витрати енергії, до-раю поставляється в ході сполученого гідролізу пірофосфатная зв'язку коферменту-нікотинамід-аденіндінуклеотіда (в бактеріальних клітинах) або АТФ (у тваринних клітинах і в бактеріофагів).
Розкручування подвійної спіралі і просторів. розділення кіл здійснюється за допомогою кількох спеціальних білків. Геліказа розплітають короткі ділянки ДНК, що знаходяться безпосередньо перед репликационной виделкою. На поділ кожної пари підстав витрачається енергія гідролізу двох молекул АТФ до аденозиндифосфату і фосфату. До кожної з розділилися ланцюгів приєднується кілька молекул ДНК-зв'язуючих білків, які перешкоджають утворенню комплементарних пар і зворотному возз'єднання ланцюгів. Завдяки цьому нуклеотидні послідовності ланцюгів ДНК виявляються доступними для реплікативної системи. Інші специфічні білки допомагають праймазою отримати доступ до матриці відстає ланцюга. У результаті праймазою зв'язується з ДНК і синтезує РНК-затравки для фрагментів відстає ланцюга. Для формування нових спіралей не потрібно ні витрат енергії, ні участі комплементарного "закручує" ферменту[3, 89-91].
У разі кільцевого реплікону (напр., у плазміди) описаний процес зв. q-реплікацією. Кільцеві молекули ДНК закручені самі на себе (суперспіралізовани), при розкручуванні подвійної спіралі в процесі реплікації вони повинні безперервно обертатися навколо власної осі. При цьому виникає торсіонне напруга, що усувається шляхом розриву одним із ланцюжків. Потім обидва кінці відразу ж знову з'єднуються один з одним. Цю функцію виконує фермент ДНК-топоізомераза. Реплікація в цьому випадку зазвичай відбувається у двох напрямках, тобто існують дві реплікаційний вилки. Після завершення реплікації з'являються дві дволанцюжкові молекули, які спочатку пов'язані один з одним як ланки одного ланцюга. При їх поділі одне з двох кілець тимчасово розривається.
Альтернативний варіант реплікації кільцевого реплікону припускає розрив в одному з ланцюжків двухспіральной молекули ДНК. Утворений при цьому вільний 3'-кінець ковалентно нарощується, залишаючись що з матрицею (другий, нерозірваної ланцюгом), а 5'-кінець поступово витісняється новою полинуклеотидной ланцюгом. Таким чином один ланцюг розмотується і безперервно подовжується, а репликационная вилка ковзає навколо кільцевої матричної ланцюга (механізм "кільця, що котиться"). У міру зростання нового ланцюга відтіснила ланцюг з звільнилися 5'-кінцем стає лінійною матрицею для синтезу нової комплементарного ланцюжка. Цей синтез на лінійній матриці продовжується до тих пір, поки не утворюється дочірня ланцюг ДНК, комплементарна одному обороту кільцевої матриці, тобто цілого реплікону. Таким шляхом з кільцевої матриці може сходити велике число комплементарних копій. Такий механізм виявлений у деяких вірусів, а також у ряді клітин еукаріот.
Ще одна схема реплікації передбачає формування структури, названої D-петлею. Відповідно до цього механізму, спочатку реплікується тільки одна з ланок кільцевого реплікону, тоді як другий ланцюг, залишаючись інтактною, витісняється, утворюючи петлю. Реплікація другий ланцюга починається з ін стартової точки і тільки після того, як реплікувати частину першої ланцюга. Такий механізм реплікації виявлений, наприклад у мітохондріальних ДНК.
Реплікація РНК (синтез РНК на РНК-матриці) вивчена менше. Вона здійснюється тільки в деяких вірусів (напр., у вірусів поліомієліту та сказу). Фермент, що каталізує цей процес - РНК-залежна РНК-полімераза (його називають також РНК-репликазу або РНК-синтетазою). Відомо кілька типів реплікації, РНК:
1. віруси, що містять матричні РНК, або мРНК [т. зв. (+) РНК], в результаті реплікації утворюють комплементарную їй ланцюг [(-) РНК], яка не є мРНК, яка використовується як матриця для синтезу (+) РНК;
2. віруси, що містять (-) РНК, в результаті реплікації синтезують (+) РНК;
3. віруси, що містять двухцепочечную РНК [(+) PHK і (-) РНК], в результаті асиметричної реплікації синтезують (+) РНК[4, 75-76].
Гіпотеза про механізм реплікації сформульована в 1953 Дж. Уотсоном і Ф. Криком, які припустили, що дві комплементарні ланцюга ДНК після їх поділу можуть виконувати функції матриць для утворення на них нових ланцюгів ДНК. У 1958 М. Мезельсон і Ф. Сталь експериментально підтвердили такий механізм реплікації.