Практическое применение ИФА.

ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии. ИФА применяется для:

· диагностики инфекционных заболеваний (выявление специфических антигенов и/или антител к ним);

· выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;

· определения уровня антител против конкретного антигена (IgA, M, G, в том числе изотипов), общего и специфического IgE;

· выявления онкомаркеров;

· определения белков сыворотки крови и др. биологических жидкостей (фибронектина, СРБ и др.);

· определения цитокинов в биологических жидкостях и т.д..

Рис. 23. Иммуноблоттинг (Атлас-руководство для студентов и врачей под ред. акад. РАМН Воробьева А.А., проф. Бычкова А.С.)

Иммуноблоттинг— качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ-инфекции.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг – blot – пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Разработаны специальные полоски с «блоттами» антигенов, на которые наносят сыворотку больного (2). После инкубации полоски отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся комплекс (антиген + антитело больного + антитело против иммуног

лобулинов человека) выделяют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.

Рис. 24. Реакция иммунофлюоресценции (Атлас-руководство для студентов и врачей под ред. акад. РАМН Воробьева А.А., проф. Бычкова А.С.).

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ

МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ

Реакция ставится с целью выявления лимфоцитов, сенси­билизированных к предполагаемому антигену. Если антиген является специфичным в данной ситуации, то диффузия лимфоцитов будет минимальной. Такая положительная проба свидетельствует о наличии фактора ингибиции.

Методика исследования.

Необходимые материалы и оборудование: среда 199, 10% раствор желатина, 5% инактивированная сыворотка человека, 0.35% раствор NaOH, тирс-буфер (рН 7,65), 0,4% раствор ЭДТА, центрифужные пробирки, центрифуга, термостат, пласт­массовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0,7 мм.

Венозную кровь смешивают с антикоагулянтом ЭДТА (рН 7.4). Эритроциты осаждают 10% раствором желатина, добав­ленным к крови из расчета 1:9. После отстаивания и осаждения эритроцитов при комнатной температуре в течение 40мии плазму, обогащенную лейкоцитами, осаждают центрифуги­рованием при 1000 об/мин в течение 7 мин. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в 0,5 мл среды 199 с 5% инактивированной сывороткой человека, добавив 4,5 мл смеси, состоящей из 9частей 0,35% раствора NaOH и 1 части трис-буфера (рН 7,65), для растворения эритроцитов. Лейкоциты отмывают и снова ресуспензируют в среде 199, содержащей 5% челове­ческой инактивированной сыворотки и 0,4% ЭДТА, затем готовят густую лейкоцитарную взвесь, которой заполняют пластмас­совые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0.7 мм

Капилляр, заполненный лейкоцитарной взвесью, прикрепляют на дно лунки глубиной 20 мм, диаметром 15 мм, которая затем заполняется средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин со стрептомицином по 10 000 ЕД на 1 мл среды и 5% инактивированной прогреванием при 56°С в течение часа человеческой сыворотки 1; можно также использовать сыворотку лошади, кролика, оспа и др.

Лунки диаметром 1,5 мм расположены в пластинке из ор­ганического стекла (4 ряда по 4 лунки). Заполненные средой и капиллярами с исследуемыми лимфоцитами лунки закрывают крышкой, края которой смазывают вазелином для герметизации. Всю систему помещают в термостат при 37°С, Учет реакции производят под лупой с малым увеличением. Микрометром, размеченным в окуляре, измеряют ширину и длину площади миграции лимфоцитов, которая вырисовывается под увеличением в еще своего рода "дерева", стволом которого является капил­ляр, а кроной - лимфоциты, располагающиеся вокруг капилляра

Регистрацию можно проводить с помощью планиметра ирисовального аппарата. Показатель торможения миграции выра­жают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свиде­тельствует о наличии фактора, ингибирующего ее.