Микробиологическая диагностика хламидийных и микоплазменных инфекций.

ЗАНЯТИЕ 23

Тема: Микробиологическая диагностика сифилиса.

Микробиологическая диагностика хламидийных и микоплазменных инфекций.

Цель: На основе знаний биологии возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.

Знать:

1. Классификацию и морфобиологические особенности возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.

2. Экологию, особенности патогенеза и иммунитета при сифилисе и заболеваниях, вызываемых хламидиями и микоплазмами.

3. Материал и методы микробиологической диагностики сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.

4. Неспецифическую профилактику и этиотропную терапию сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.

Уметь:

1. Учитывать и оценивать результаты реакции микропреципитации, РНГА при серологической диагностике сифилиса.

2. Учитывать и оценивать результаты непрямой РИФ с материалом от обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз.

3. Учитывать и оценивать результаты ИФА с сывороткой обследуемого и хламидийным антигеном.

4. Учитывать и оценивать результаты биохимического теста с материалом обследуемого с подозрением на урогенитальный микоплазмоз.

5. Учитывать и оценивать чувствительность возбудителя урогенитального микоплазмоза к антибиотикам.

Контрольные вопросы:

1. Систематическое положение возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.

2. Морфобиологическая характеристика возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.

3. Экология, эпидемиология, особенности патогенеза и иммунитета при сифилисе, хламидийных и микоплазменных инфекциях.

4. Материалы и методы микробиологической диагностики сифилиса и заболеваний, вызываемых хламидиями, микоплазмами.

5. Неспецифическая профилактика и этиотропная терапия сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести серодиагностику сифилиса, для чего:

1.1. Поставить, учесть и оценить результаты реакции микропреципитации с инактивированными сыворотками обследуемых (С1, С2, СЗ, С4, С5).

1.2. Учесть и оценить результаты РПГА с сыворотками обследуемых, у которых реакция микропреципитации была положительна.

На основании полученных результатов сформулировать вывод.

2. Провести микробиологическую диагностику урогенитального хламидиоза, для чего:

2.1. Учесть и оценить ИФА с сывороткой обследуемого на урогенитальный хламидиоз и хламидийным антигеном C. trachomatis.

2.2. Учесть и оценить РИФ непрямую с материалом от обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз.

3. Провести исследование соскоба из цервикального канала от обследуемой с бесплодием с помощью тест-системы Mycoplasma DUO, для чего:

3.1. Выявить наличие микоплазм и определить их количество.

3.2. Определить чувствительность культуры к антибиотикам.

На основании полученных результатов сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

4. Описать биопрепараты: антиген для реакции Вассермана, кардиолипидный антиген для реакции микропреципитации.

Методические указания, выполняемые в ходе УИРС:

I. Проведите серологическое исследование по обнаружению антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови обследуемых, для чего:

1.1. Поставьте, учтите и оцените результаты реакции микропреципитации с инактивированными сыворотками крови обследуемых (С1, С2, СЗ, С4, С5).

Техника постановки реакции микропреципитации (МПР):пастеровской пипеткой набирают инактивированную сыворотку крови каждого обследуемого и вносят по 3 капли в лунки планшета, куда затем добавляют по 1-й капле кардиолипинового антигена. Ингредиенты смешивают встряхиванием планшета в течение 5-ти минут, добавляют 3 капли физ. раствора, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28°С). Одновременно ставят контроли сывороток: КС"+"- сыворотка, заведомо содержащая антитела к возбудителю сифилиса, КС"-"-сыворотка, заведомо не содержащая антитела к возбудителю сифилиса.

Учет: результат учитывают визуально по появлению хлопьев в лунках, что является свидетельством положительной реакции.

Критерии достоверности: положительная МПР с контрольной сывороткой КС"+" и отрицательная реакция - с контрольной сывороткой КС"-".

Оценка: положительная реакция микропреципитации свидетельствует о возможном наличии антител в сыворотке обследуемых и выявлении заболевания сифилисом. Отрицательный результат свидетельствует о серологическом не подтверждении заболевания.

В настоящее время при серодиагностике сифилиса рекомендовано использовать в качестве скрининговых (отборочных) методов МПР с кардиолипиновым антигеном, РСК с кардиолипиновым антигеном – реакцию Вассермана (приказ №87 от 26.03.2001 МЗ РФ «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»). Поскольку МПР технически более простая, требует меньше времени на постановку, то при микробиологической диагностике она используется чаще.

1.2. Учтите и оцените результаты РПГА с сыворотками обследуемых, у которых МПР была положительна (см. занятие № 10).

МПР и РСК не являются специфическими и в ряде случаев дают ложноположительный результат. Для распознавания ложноположительных результатов и подтверждения результатов отборочных реакций используют специфические, чувствительные реакции. К их числу относятся РПГА, ИФА, РИТ (реакция иммобилизации трепонем), РИФн. Недостатками РИТ и РИФн является техническая сложность, длительность постановки, высокая стоимость исследования; кроме того, приблизительно у 85% адекватно пролеченных больных эти реакции остаются положительными в течение нескольких лет и даже в течение всей жизни, поэтому не могут быть использованы в качестве контроля излеченности.

II. Проведите микробиологическую диагностику урогенитального хламидиоза, для чего:

2.1. Учтите и оцените ИФА с сывороткой обследуемого на урогенитальный хламидиоз и хламидийным антигеном C. trachomatis (см. занятие №11).

2.2.Учтите и оцените непрямую РИФ с материалом от обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз (см. занятие №11).

Результат РИФн считается положительным, если в мазке выявляют ярко-зеленые светящиеся мелкие, круглые (элементарные тельца хламидий) или овальные (ретикулярные тельца хламидий) частицы. Тельца располагаются отдельно, на поверхности эпителиальных клеток или внутриклеточно. Эпителиальные клетки окрашены в красно-оранжевый цвет.

Результат считается отрицательным, если в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 50 эпителиальных клеток.

III. Проведите исследование соскоба из цервикального канала от обследуемой с бесплодием с помощью тест-системы Mуcoplasma DUO, для чего:

3.1. Выявите наличие возбудителя и определите его количество.

Набор Mуcoplasma DUO позволяет культивировать, идентифицировать и дифференциально титровать урогенитальные микоплазмы, а также определять чувствительность культуры к антибиотикам. Метод позволяет получить результаты в течение 24-48 ч.

Материалом для исследования являются соскобы из уретры, цервикального канала, влагалища (реже – из глотки, назофарингиальной зоны, конъюнктивы у детей). Так как микоплазмы прилипают к поверхности эпителиальных клеток, следует хорошо поскоблить слизистую. Затем тампончик (предпочтительно специальный цитологический тампончик Bactopick) погружается в 2 мл транспортной среды и взбалтывается, чтобы смыть все клетки в среду.

Идентификация и титрование урогенитальных микоплазм основаны на специфических метаболических свойствах каждого микроорганизма, которые гидролизуют:

- Ureaplasma urealiticum (UU) – мочевину;

- Mycoplasma hominis (MH) – аргинин.

При этом образуется ион аммония и происходит защелачивание среды. Вследствие этого изменяется цвет (с желтого на красный) индикатора кислотности среды, что позволяет визуализировать реакцию. Таким образом, при желтой окраске содержимого лунок – микоплазмы отсутствуют, при красной окраске – микоплазмы присутствуют в пробе. Если покраснела лунка U – в пробе присутствует UU; если покраснела лунка Н – в пробе присутствует МН; если покраснели лунки U и Н – в пробе присутствуют и UU, и МН.

Т и т р о в а н и е (определение количества) основано на принципе разведения исследуемого материала в жидкой среде. Проба последовательно разводится в транспортной среде, в лунке D (разведение 10-1) и, наконец, в лунках U > 104 и Н > 104 (разведение 10-2). Таким образом, может быть определен титр микоплазм. Этот титр соответствует лунке, цвет которой изменился на красный через 24-48 ч инкубации.

Данный набор позволяет определить титры порядка 10-3 – 10-4 мл, которые уже считаются этиологически значимыми.

Учет результатов: первые результаты считываются через 24 ч инкубации. При наличии положительной реакции в лунке с высоким титром (104), получают окончательный результат. Второй раз считывают результаты через 48 ч в следующих случаях:

- если нужно подтвердить отрицательный результат,

- определить присутствие микоплазм в низких титрах,

- определить штаммы, присутствующие в высоком титре, но характеризующиеся медленным метаболизмом.

3.2. Определите чувствительность культуры к антибиотикам.

Микроплата для определения чувствительности к антибиотикам включает два ряда по 8 лунок, содержащих различные антибиотики. Разные концентрации антибиотиков в лунках позволяют получить профиль чувствительности тестируемых микоплазм (чувствительная, умеренно устойчивая, устойчивая). Лунки Тс служат контролем роста без антибиотиков. Определение осуществляется с использованием содержимого лунки Х набора Mуcoplasma DUO.

Оценка-интерпретация. Тест интерпретируется тогда, когда контрольные лунки роста изменят цвет с желтого на красный. На практике плата исследуется через 24 ч и через 48 ч для установления низкой резистентности:

- 2 желтых лунки – отсутствие роста (чувствительна),

- 2 красных лунки – рост в присутствии антибиотиков (устойчива),

- лунка с низкой концентрацией антибиотика – красная, лунка с высокой концентрацией антибиотиков – желтая (умеренно устойчива).

Для клиндамицина и пристинамицина используется лишь одна концентрация антибиотика, поэтому возможны только два варианта результата: культура чувствительная или устойчиваяая.

Наши рекомендации