Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовле­ние мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка.На обезжиренное спиртом предметное стекло поме­щают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей не­большое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавлен­ная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на пло­щади 1 — 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько то­нок, чтобы быстро высыхал после приготовления.

Высушивание мазкалучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация препаратапреследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распростра­ненным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препа­рат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внеш­него вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строе­ния клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами (см. приложение 5). Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Окраска.Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилино­выми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относят­ся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей слу­жат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связы­ваются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологи­ческой практике применяются почти исключительно основные красители.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В пер­вом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только опреде­ленные структуры клетки и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуют­ся фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксирован­ный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 — 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стека­ющая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позво­ляет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильт­ровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фикси­рованные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Форму клеток и их расположение (цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светло-польной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы кле­ток мелких палочковидных бактерий, таких как Serratia marcescens, готовят пре­парат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мел­ких бактерий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella и некоторые другие), целесообразно исследовать мето­дом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток».

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культи­вирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.