Тақырып. Қоршаған ортаның мутагендер, канцерогендермен ластануын анықтайтын және деңгейін бағалайтын негізгі тест-жүйелер

Түрлі факторлардың мутагендігін бағалау тест-жүйелердің көмегімен жүргізу қажет. Көптеген жүргізіліп жатқан жұмыстарға қарамастан, қазіргі кезде бар тест-жүйелердің біреуі де зерттеліп отырған қосылыстардың адамға қатысты мутаген екендігін немесе еместігін көрстетеін 100%-тік тиімділігі жоқ.

Қазіргі кезде жүздеген тест-жүйелердің белгілі болуына қарамастан, биотестілеу кезінде олардың жақсы сипатталған онға жуығы ғана қолданылады. Әрбір тест-объектіде қоршаған ортаның күйін анықтайтын көрсеткіштердің біреуі ғана қолданылады. Бұл көп жағдайда хромосома аберрациясы, сестринские хроматидтік алмасулар, анеуплоидты клеткалардың жиілігін бағалау және микроядролық тест. Алайда айтылған көрсеткіштер барлық жағдайда қолданылмайды және олар қымбат. Сондықтан оларға қосымша жаңа көрсеткіштерді интегралды бағалау үшін қолдану қажет. Осындай көрстекіштерді бірге бір тест-жүйеде пайдалану оның сезімталдығын жоғарылатуға көмектеседі. Сонымен қатар бірнеше тест-жүйелерді пайдалан­бауға да әкелуі мүмкін.

Қоршаған ортаның мутагендігімен канцепргендігін анықтау және бағалау үшін микроорганизмдерді қолдану. Қоршаған ортаның мутагендігін анықтау үшін қолданылатын ондаған тест-жүйелердің ішінде ең сезімталдары және репрезантивтілері болып микроорганизмдер болып табылады.

1. Микроорганизмдер кезкелген экожүйенің тұрақты компоненті болып табылады.

2. Микроорганизмдердің репродуктивті периодыминималды, генотиптердің алмасуы қысқа уақытта өтеді.

3. Бактериялардың хромосомалар жинағы заплоидты және генотиптің бұзылуы фенотиптік көрініске бірден ие болады. Фенотип өзгерістерін тіркеу тәсілдері жақсы жасалған.

4. микроргинзмдерде жүргізілген тестілер экономикалық жағынан тиімді және тез уақытта ақпарат алуға және жеке тәжірибелер арасындағы статистикалық маңызды емес деңгейде өзгергіштікті алуға мүмкіндік береді.

Вирустық тест-жүйелер. Вирустар клетканың кейбір қызметінің индикаторы ретінде қарастырылады. Олар қосылыстардың мутагендігін анықтаудың тест-жүйесі ретінде қарастырыла алады. Бұл құрамында РНҚ да, ДНҚ да бар вирустарға қатысты. Адам мен жануарларға қатысты мутагендердің вирустардың көпшілігіне мутаген болатындығы анықталды.

Бактериалдық тест-жүйелер. Эймс тесті. Бұл тәсілдің мәні келесіде - Salmonella typhimurium индикатор штаммдарында гендік мутацияны туғызуға химиялық қосылыстың немесе оның метаболитінің қабілетін тіркеу қабілетінде. Бұл тәсіл ортаның мутагендігін анықтауда қолданылатын экспресс тәсілдердің кең тараған түрі. Эймс тесті екі компоненттен тұрады: тіркеу және активтендіретін. Тіркеу компонентін S. Typhimurium штаммдары құрайды. Активтендіретін компонентінде микросомалық тотығу жүйесінің қызмет етуі үшін қажет тышқан бауырының гомогенантты постмитохондриалды супернатанты (S-9 фракциясы) және кофакторлар бар. SOS-хромотест. Бұл тест мутациялық процестің SOS-репарацияның қызмет етуінің салдары туралы қазіргі кездегі түсінккі негізделген. SOS-хромотест генотоксиндердің бар-жоқтығына жүргізілетін сапалық колориметрлік тест. Бұл тест көмегімен түрлі қосылыстардың немесе олардың метаболиттерінің мутагендігін Escherichia сoli клеткаларында байқайды.

Саңырауқұлақтар мутагендерді анықтау үшін қолданылатын тест-объект. Фитопатогендердің ішінде саңырауқұлақтар басты орын алатындықтан бұл организмдердің өкілдері тест-объектілер ретінде қолданғаны жақсы. Бұл тәсілмен пестицидтердің және басқа қосылыстардың мутагенділігі анықталады.

Сүтқоректілерді қоршаған ортаның мутагендік және канцепргендік факторларын анықтау және бағалау үшін тест-объектілер ретінде пайдалану. Кезкелген тест-жүйе барлық мутагендерді анықтай алмайтындықтан Әлемдік денсаулық сақтау ұйымының мамандары бірнеше тест-жүйелерді, соның ішінде әсіресе сүтқоректілерге негізделген тест-жүйелерді пайдалану дұрыс деп санайды. Сонымен қатар, бірқатар in vitro тест-жүйелері және субсүтқоректілерге жүргізілген тест-жүйелерді арнайы сұрақтарды шешу үшін қолдануға болады. Мутагендікті анықтаудың жануарларда жүргізілетін келесі цитогенетикалық тәсілдері бар: микроядролық тест, хромосомалық аберрациялардың метафазалық анализі, сестринские хроматидтік алмасулар, тұқым қуалайтын транслокацияларды тіркеу, инверсияларды тіркеу тәсілі, доминантты леталды мутацилардың цитогенетикалық тест, ерте эмбриондарға жүргізілген цитогенетикалық тест, доминантты леталдардың анализі, Рецессивті жыныспен тіркескен леталды мутациялар, соматикалық мозаиктер тәсілі, аномалды спермияға тест және т.б.

Адам қанының лейкоциттері – қоршаған ортаның мутагендік әсерін анықтауға арналған тест-жүйе.Химиялық қосылыстардың мутагендік әсерін зерттегенде (әсіресе өнеркәсіпте) жиі адам қанының лимфоциттері қолданылады. Бұл жүйенің басқа тест-жүйелерге қарағанда бірнеше артықшылықтары бар:

1. Материалды тікелей донорлардан немесе қан құю орталықтарында алуға мүмкіндік бар;

2. Тәжірибегеқолданылатын клетка популяциясының көп болуы, мысалы, қанның 1мл-де 1-3x10⁶ кіші лимфоциттер бар;

3. Лейкоциттер популяциясының синхрондығы, себебі, шеткі қанның барлық клеткалары тыныштық кезеңінде болады;

4. Лейкоцит популяциясының белок-полисахаридтік комплексі бар қосылыстармен еткенде клеткалық цикл бойынша қозғалуының басталуын реттеуге мүмкіндік;

5. лейкоциттерді өсіру, фиксациялау және препарат дайындау жақсы қойылған;

6. Хромомомалардың қайта құруларының зерттелгендігі, олардың табиғи жағдайда сирек болуы;

7. Материалды фиксациялау уақыты туралы мәліметтің лейкоцит клеткаларының популяциясының бірінші және соңғы клеткалық цикл бойынша жылжуы туралы мәселелердің шешілуінің зерттелгендігі;

8. Бірінші клеткалық бөлінуде G1,S, және G2 фазаларының өту ұзақтығының белгілі болуы. Микроядролық тест. Ол мутагендердің адамға әсерінің индикаторы ретінде де зерттейді. Бірінші зерттеулерде мутагендік әсерлерге дұшар болған адамның жілік майы және лимфоциттері қолданылды. Микроядролардыадамның шеткі қанының эриторциттерінде де зерттеуге болады. Алайда бұл еңбекті көп қажет етеді.

Көпкомпонентті қоршаған ортаның мутагендік және канцепргендік әсерін анықтауға арналған тест-жүйелер. Жоғарыда жеке алынған тест-жүйе барлық мутагендерді анықтай алмайтындығы айтылды. Сондықтан копкомпонентті тест-жүйелерді құру қажет. Оған келесі таоаптар қойылады: 1)құрамында про- және эукариоттық организмдер болуы қажет; 2) тірі организмдердің негізгі патшалықтарының өкілдерін қамту қажет; 3) лабораториялық жағдайда жақсы өсетін тест-организмдердер болуы қажет; 4) ортаның кең тараған ластаушыларына сезімтал организмдерді қамту қажет; 5) биологиясы, экологиясы жақсы зерттелген және таралу ареалы кең организмдерді кеңірек қолдану қажет; 6) включать такие қымбат және тіркеу үшін күрделі аппаратураны қажет етпейтін, бірақ көп мағлұмат беретін тест-реакциялары бар тест-организмдерді қолдану.

Қоршаған ортадағы ластаушылардың мутагенділігін өсімдік тест-жүйелері арқылы цитоге­нети­ка­лық әдістермен анықтау

Өсімдік клеткаларының хромосомалары цитогенетикалық эксперименттерде кеңінен қолданылады. Хромосомалардың мутагенділігін зерттеу үшін, жануарларға қарағанда өсімдік хромосомалары мөлшері, суреттерінің нақтылығы және басқа параметрлері жағынан таптырмайтын объект болып саналады. Хромосома аберрациясына анализ жасау үшін, өсімдік ұлпаларынан алынған, интенсивті бөлінетін клеткалардан жасалатын, уақытша немесе тұрақты препараттар қолданылады. Әдетте, меристеманың біріншілік және екіншілік немесе жапырақтың өсу аймағынан алынады.

Пестицидтердің кариотоксикасына баға беру үшін қолданылатын тест-жүйелар, соматикалық өсімдік клеткаларының ауытқуларына негізделген. Бұл, мутагендерден химиялық қорғаныс жасаудың алғышарттары, осының негізінде потенциялдық генетикалық қауіптілікке баға беріледі. Хромосомалардың құрылымының бұзылуын зерттеу, қоршаған ортаны ластаушылардың деңгейіне көрсеткіш болады. Хромосома аберрациясының қалыптасуы, гендік мутацияның индукциясымен өзара байланысты. Өсімдіктің соматикалық клеткасындағы хромосомалардың қайта құрылуын анықтаудың екі әдісі бар: метафазалық және анафазалық.

Метафазалық әдіс. Хромосомалардағы қайта құрылуларды анықтаудың метафазалық әдісі, хромосома­лардың құрылымдық өзгерулерініе анализ жасайды, яғни ол, митотиклық бөлінудің метафазасына дейін жетеді. Осы әдіс ақылы, тек қайта құрылудың сандық мөлшерін ғана емес, сонымен қатар, хроматидтік, хромосомдық өзгерулерді нақ анықтап, қайта құрулардың барлық типі мен нұсқасын көруге болады. Хромосома аномалияларының метафазалық әдіспен толық және детальді анализденуі, химия, медициналық генетика, космостық биология және экологияның басқа да салалары үшін өте бағалы [Немцева, 1970]. Өсімдіктерді экспериментке қатысынсыз алдын-ала өңдеу себебі, метафаза сатысында клеткалардың максимальді мөлшерде жиналып қалуына байланысты. Бұл әдетте, клеткалардың парасинхрондығына байланысты, мысалы, ДНК синтезінің ингибиторлар көмегімен (5-аминоурацилмен немесе колхицинмен) клетканың метафаза сатысында тежелуі, митотикалық ұршықтың бұзылуынан болады [Макаров, Сафронов, 1978].

Анафазалық әдіс. Хромосома аберрациясын зерттеу – қоршаған ортаның мутагендермен ластануының негізгі критериі болып табылады. Хромосомаға анафазалық анализ жасау, аберрацияларды жылдам және оңай табуға мүмкіндік берді. Бұл әдіс делециядағы өзгерулерді фрагменттер түрінде тіркейді: ассиметриялық транслокация – көпір, изохроматидті делеция – жұп хроматид фрагменттері, парацентрлік делеция – ацентрлік фрагмент және микрофрагмент.

Бірақ, мутагенді ластаушыларға баға беру үшін қолданылатын әдістер жайлы қарама-қайшы ойлар бар. Кейбіреулер ксенобиотиктердің мутагенділігін анафазалық әдіспен бағалаған жылдамырақ дейді. Көптеген жұмыстардың нәтижелері көрсеткендей, метафазаға қарағанда анафазалық әдіспен көбірек аномалиялар табыған. Бұл, агенттің табиғатына байланысты (қайта құрылудың қандай типін шақырады), сонымен қатар, әртүрлі объекттердің хромосомаларының қосылуының ұқсас болмауы [Иофа, Митин, Нилова, 1984]. Басқа авторлардың ойлары бойынша, анафазаға қарағанда метафазалық әдіспен көбірек аномалиялар табуға болады, себебі, анафазалық әдіс, кариотипінде хромосома жиынтығы көп өсімдіктерге ғана қолданылады. Сондықтан, мамандардың басым бөлігі метафазалық әдісті жоғары бағалайды. Хромосомалық әдіске жоғары митотикалық индексті, интенсивті бөлінетін ұлпалар қажет. Кариологиялық зерттеулердің табысы тек материалдың сапасына ғана емес, сонымен қатар, өсіру шартына, бекітуге, мацерацияға, бояуына, препаратты езуге және басқа да факторларға байланысты [паушева, 1988; Турков, 1986; Босток, Самнер, 1980].

Тозаңның аналық клеткасының микроспорогенезі. Мутагендік әсер, өсімдіктердің аналық клеткаларының, тозаңның даму сатыларына, тозаңдық дәндердің қалыптасуына және олардың қызмет атқаруларына прогрессивті негативті әсер етеді. Хромосомалардың мейотикалық бөлінуіндегі көптеген бұзылулар – I және II бөлінуіндегі анафаза және телофазадағы көпіршелер, жеке хромосомалардың элиминациясы және қалып кетуі, монада тетрадаларымен қатар қалыптасу, диаджәне басқа аномалийлер – тозаңның маңызды морфологиялық әртүрлі сапалығының, өмір сүру қабілетінің төмендеуінің және фертильдігінің себептері болып табылады [Егоркина, Зарубина, Кириллов, 2000].

Ағаш, бұта және шөптесін өсімдіктерінің, декоративті және ауылшаруашылық дақылдарының микрогаметогенез сатысындағы әртүрлі бұзылулар үлкен елді мекендердің ауа бассейндеріндегі кластогендер мөлшерін, өндіріс кәсіпорындарын, автострадаларды, пестицидтерді және басқа да қоршаған ортаны ластауыш көздерін бағалау үшін қолданады.

Гүлді өсімдіктерде аталық жыныс клеткаларының қалыптасуы мейозбен байланысты. Гүл тозаңдықтарының мейозын байқау үшін алдымен өсімдік масақтарының қынаптан шығуына дейінгі кезеңін жазып алу керек (масақтың қынаптан шығуына 3см қалғанда). Фиксатор ретінде Карнуа немесе Ньюкомер фиксаторлары пайдаланылады. 10-12 сағаттан кейін тозаңдықтарды 70%-тік спиртпен жуып, фиксацияланған материалды 70-80%-тік этил спиртінің ерітіндісіне салып, тоңазытқыштың ішінде сақтайды. Жас тозаңдықтардан жасалған уақытта препараттардан хромосомалар бұзылуын, I метафаза бөлінуіндегі хромосомаларды санауға және мейоз жолын көруге болады. Фиксацияланған материалды пинцет арқылы кішкентай бөліктерге үгітіп, препаратты спиртовкада қыздарып, ацетокарминмен бояйды. Объектті езгіеу сірке қышқылының 45%-тік ерітіндіде жүреді. Препарат боялғаннан кейін, шеттерін парафинмен жабыстырады немесе Гойер ерітіндісіне салынады. Анализ кезінде мейоз сатысындағы барлық бұзылуларға көңіл бөлу керек: профаза 1; метафаза 1; анафаза 1; телофаза 1; профаза 2; метафаза 2; анафаза 2; телофаза 2.

Тозаңның стерилдігі. Гүлді өсімдіктердің тұқым арқылы көбею жүйесінде амфимиксистің болмауы тән екені белгілі. Осындай түрлердің тозаңдары әртүрлі деңгейде дифференциацияланған. Бұл – стерилді тозаңдар пайызы көп екенін, тозаң дәндердің көлемдерінің және формаларының түрленуі және олардағы саңылаулардың саны, гистохмимялық зерттеулерде интенсивті бояуды көрсетеді. Керісінше, амфимиксті түрлер үшін жағымды жағдайда аталық стерилдігінің спонтанды дәрежесінің дамуы 10%-тен аспайды. Оларда морфологиялық тегістелген тозаңдары бар. Биоиндекацияға амфимиксисі және жоғары спонтанды мутабильдігі бар, мутагендерге жоғары сезімталдығы бар популяциялар жарамды [Егоркина, Зарубина, Кириллов, 2000].

Мутагендердің өсімдіктерге әсер ету мінезін анықтау үшін тозаңның бірқатар генетикалық сипаттамалары қолданылады. Олар: түрі, формасы, өрнектелуі, стерилдігі және өмір сүру қабілеттілігі, түрішілік сыйымсыздық, ақуыз және крахмалдың мөлшері [Олимпиенко, 1988]. Мониторингтік зерттеулерде тозаң­дардың кең қолданылуы, олардың фитотоксиканттарға өте сезімталдылығымен түсіндіріледі [Бессонова, Лыжен­ко, 1991]. Оның гаплоидты жағдайы тозаңның түзілу процесінде пайда болатын летальді мутацияларды көрсетеді [Бессонова, Грицай, Юсыпова, 1996]. Антропогендік ластанған аймақтарда редукциямен келісілген археспория клеткаларында, цитопатологиямен келісілген генративті организмдерде, мейоз бұзылуларында стерилдіктің жоғарылауы байқалады. Өсімдіктің стерилдігі 50-80%-ке дейін өседі [Бондарь, Частоколенко, 1990; Бессонова, Лыженко, 1991; Олимпиенко, 1988; Бессонова В.П., Грицай З.В., Юсыпова, 1996].

Тозаңның фертилдігі негізгі генетикалық белгі ретінде бола алады. Ол аталық гаметофитінің мутагендік өңдеудің дәрежесіне реакциясын сипаттайды және скрининг, қоршаған ортаның мониторингі және селекция жолында айтарлықтай сезімтал маркер бола алады. Популяция немесе бөлек өсімдік болсын, кез келген экосистемада тозаң экологиялық хабардың негізгі көзі екенін ескере отырып, тозаңның фертилдігінің көлемі және өзгергіштігі генетикалық жүктің деңгейін жеткілікті мөлшерде көрсете алады деп жорамалдасақ болады. Бұл гентикалық жүк популяцияда өсімдіктердің индукцияланған мутагенездегі гентикалық бұзылулардың жиналуынан пайда болады. Мысалы, шалғындық овсяница [ындағы Олимпиенко, 1988]. Стерилдіктің барлық түрлерін популяцияның гентикалық көптүрлілігінің, ішкі және популяция аралық қатынастардың төмендеуіне әкелетін генетикалық элиминация ретінде қарастыруымыз керек [Бондарь, Частоколенко, 1990].

Тозаңның стерилдігі негізінен ацетокармин әдісімен анықталады. Фертилді тозаң дәндерімен цитоплазмасы түйіршікті және спермилері қою қызыл түске боялады, ал стерилді тозаң дәндері ацетокарминмен боялмайды десе де болады. Кейбір дақылдардың тозаң дәндерінің ұрықтандыру қабілетін иодтық әдіспен анықтауға болады. Оның негізінде крахмалды иодты реакция көмегімен анықтау жатыр. Себебі, фертилді және стерилді тозаң дәндерінің айырмашылығы – полисахаридтер мөлшерінде.

Тозаңның өмір сүру қабілеттілігі. П.И. Диаконның әдісімен анықталады. Тозаңның өмір сүру қабілеттілігін сукциндегидрогеназа активті тыныстық ферменттердің болуымен жориды. Бұл ферменттің қатысуынан түссіз 2, 3, 5-хлорид трифенилтетразол ерітіндісі қайта жарық қызыл түсті формазан қалпына келеді. Өлген тозаң дәндері түссіз болып қалады. Бұл әдіс көптеген ауылшаруашылық дақылдармен жұмыс істегенде нақты нәтиже береді.

Липидтерді асқын тотықты қышқылдандыру әдісі. Аға өсімдіктерінің жапырақтарындағы липидтердің интенсивті асқын тотықты қышқылдандыру анализіне негізделген қаладағы генотоксикалық жағдайды анықтайтын жаңа әдіс ұсынылған. Соңғы жылдары мутациялық процестің пайда болуының негізгі ролі – оттегінің активті формаларына және липидтердің асқын тотықты қышқылдануының өнімдеріне берілетіндгі көрсетілген. Е.П. Гуськов және оның қызметкерлері 2000 жылы хромосомалар аберрациясының деңгейі мен липидтердің асқын тотықты қышқылдануының өнімдері арасынан жағымды корреляцияны тапты. Бұл биохимиялық әдістерді қолдануға мүмкіндік береді. Бұл әдістің негізгі қасиеті – көпжылдық мониторингті өткізу.