Окислювальне фосфорилювання

Розглянуті вище реакції окислення – відновлення різних субстратів, що здійснюються в живих організмах у процесі внутрішньоклітинного обміну, дістали назву біологічного окислення. Процеси біологічного окислення, що проходять у клітинах гетеротрофних організмів, є основним джерелом енергії, необхідної для забезпечення їхньої життєдіяльності. Енергія, що виділяється при анаеробному та аеробному окисленні різних субстратів, нагромаджується в макроергічних зв'язках АТФ – універсальної сполуки, яка може виступати в ролі акумулятора, трансформатора та донора енергії. Близько 50 % енергії окислення органічних сполук резервується в макроергічних зв'язках АТФ. Утворюється АТФ з АДФ і активного фосфату, причому активація останнього і перетворення його на активний фосфорил відбуваються за рахунок енергії окислення органічних сполук. Синтез АТФ з АДФ і неорганічного фосфату, активація якого спряжена з процесами окислення в організмі, називається фосфорилюючим окисленням. Залежно від принципу енергетичного спряження розрізняють фосфорилююче окислення на рівні субстрату та на рівні електронно-транспортного ланцюга. Фосфорилююче окислення на рівні субстрату – це синтез АТФ з АДФ і активного фосфорилу внаслідок перенесення його з продукту окислення субстрату на АДФ. Так синтезується незначна кількість АТФ. Реакції фосфорилюючого окислення на рівні субстрату здійснюються зокрема в процесі анаеробного окислення вуглеводів. Так, у процесі окислення глюкозо-6-фосфату утворюється субстрат, що має макроергічний зв'язок – 1,3-дифосфогліцеринова кислота, яка може передавати активний фосфорил на АДФ, внаслідок чого утворюється молекула АТФ (див. обмін вуглеводів).

У процесі гліколізу проходить ще одна реакція фосфорилюючого окислення (на рівні субстрату) – при перенесенні активного фосфорилу з фосфоенолпірувату, продукту окислення глюкозо-6-фосфату на АДФ (див. обмін вуглеводів).

На третьому етапі виділення енергії (під час аеробного окислення в циклі Кребса) також відбувається реакція фосфорилюючого окислення на рівні субстрату – під час перенесення активного фосфорилу з сукцинілфосфату на ГДФ (див. обмін вуглеводів). Утворена молекула ГТФ вступає в обмінну реакцію АДФ, внаслідок чого утворюється молекула АТФ:

ІТФ + АДФ ® АТФ + ГДФ.

Другий вид енергетичного спряження – фосфорилююче окислення на рівні електронно-транспортного ланцюга – здійснюється в процесі тканинного дихання або біологічного окислення на рівні електронно-транспортного ланцюга.

Значний внесок у з'ясування цього механізму зробили В.П. Скулачов, С.Є. Северин, П. Мітчелл. Дослідженнями було встановлено, що в процесі біологічного окислення під час перенесення протонів та електронів по системі дихального ланцюга, спряжених з процесами окислення, на певних його ділянках відбувається активація неорганічного фосфату і перетворення його на активний фосфорил, який взаємодіє з АДФ і забезпечує синтез АТФ. При перенесенні електронів по системі дихального ланцюга вільна енергія системи поступово зменшується. Згідно з розрахунками, стандартна зміна вільної енергії системи при перенесенні двох електронів по системі дихального ланцюга становить 220 кДж, що достатньо для синтезу 6 – 7 молекул АТФ (враховуючи, що вільна енергія гідролізу АТФ в середньому дорівнює 30,6 кДж; 220 : 30,6 = 7). Однак дослідженнями було встановлено, що при перенесенні двох електронів по системі дихального ланцюга синтезується лише три молекули АТФ, тобто існує три пункти спряження, на яких процес окислення забезпечує активацію неорганічного фосфату і перенесення активного фосфорилу на АДФ. Саме на цих ділянках рівень зміни вільної енергії системи достатній для синтезу АТФ:

Перша молекула АТФ синтезується при перенесенні електронів і протонів від нікотинамідних до флавінових коферментів, друга – при перенесенні електронів від цитохрому b до цитохрому с, третя – утворюється на ділянці перенесення електронів з цитохромоксидази (аа₃) на кисень. Отже, під час окислення двох атомів водню в дихальному ланцюгу утворюється три молекули АТФ.

Ступінь спряження окислення і фосфорилювання може бути різний, залежно від умов та стану клітини. Показником спряження окислення і фосфорилювання є коефцієнт Р/О (коефіцієнт фосфорилювання) або відношення зв'язаного неорганічного фосфату до поглиненого в процесі дихання кисню (Р/О = 3, якщо первинною дегідрогеназою є НАД+ і Р/О = 2, якщо водень з субстрату відщеплюють флавінові дегідрогенази). Інтенсивність процесу фосфорилюючого окислення регулюється співвідношенням АТФ/АДФ. Чим менше це співвідношення, тим інтенсивніше відбувається процес дихання та утворення АТФ.

Фосфорилююче окислення на рівні електронно-транспортного ланцюга відбувається в мітохондріях. Ферментні системи, що каталізують даний процес, локалізовані у внутрішніх мембранах мітохондрій:

Враховуючи їхні функції в спряженні процесів окислення і фосфорилювання, В.П. Скулачов назвав їх „спряжуючими”. Оскільки в процесі фосфорилюючого окислення на рівні електронно-транспортного ланцюга утворюється основна маса АТФ – сполуки, якій належить центральна роль в енергозабезпеченні організму, мітохондрії дістали назву „енергетичних станцій” клітини. Існує кілька гіпотез щодо пояснення механізму фосфорилюючого окислення в процесі біологічного окислення на рівні електронно-транспортного ланцюга.

Хімічна гіпотеза. В основу всіх хімічних гіпотез покладено уявлення про те, що окислення субстратів сприяє утворенню макроергічних зв'язків між неорганічним фосфатом та певними органічними сполуками, з яких він переноситься на АДФ. Хімічна гіпотеза була запропонована Ліпманом. Суть її полягає в тому, що енергія, яка виділяється при перенесенні електронів у дихальному ланцюгу, спочатку використовується для утворення певних гіпотетичних, багатих на енергію сполук, а потім передається для синтезу АТФ. Схематично цей процес можна показати так:

А-Н₂ + Х + Б D А~X + Б-Н₂;

А~Х + Ф_н = А + Х~Ф;

X~Ф + АДФ = X + АТФ,

де А і Б – речовини, що переносять електрони; Ф_н – неорганічний фосфат; X – невідома, гіпотетична речовина.

Однак хімічна гіпотеза до цього часу не дістала експериментального підтвердження.

Конформаційні гіпотези. Ці гіпотези пояснюють синтез АТФ з АДФ і неорганічного фосфату внаслідок конформаційних переходів, які виникають під час окислення. Проте гіпотези експериментального підтвердження не знайшли, хоча окремі моменти їх були використані П. Мітчеллом при розробці хеміосмотичної концепції спряження процесів окислення та фосфорилювання на рівні електронно-транспортного ланцюга, яка нині є загальноприйнятою. Основним постулатом гіпотези є те, що під час функціонування електронно-транспортних ланцюгів виникає осмотична енергія (енергія концентраційного градієнта), яка використовується для здійснення хімічної роботи – синтезу АТФ (звідки і назва – хеміосмотична гіпотеза), тобто гіпотеза передбачає перехід хімічної енергії, що виділяється під час транспорту електронів, на градієнт мембранного електрохімічного потенціалу іонів водню та перетворення останнього на стабільну енергію макроергічних зв'язків АТФ. Рушійною силою процесу фосфорилювання є градієнт електрохімічного потенціалу протонів водню (D`mН+), що виникає на спряжуючій мембрані, яка має високий електричний опір та низьку проникність для заряджених часточок (іонів Н+ та ОН–). Перенесення їх забезпечується протонними насосами, які відкачують протони з матрикса в міжмембранний простір (проти градієнта концентрації), внаслідок чого відбувається закислення міжмембранного простору. Зовнішня частина спряжуючої мембрани при цьому набуває позитивного заряду. Однак у матриксі створюється надлишок іонів ОН–, що призводить до підлуження середовища та появи негативного заряду на внутрішній частині спряжуючої мембрани (збоку матрикса). Отже, електрохімічний потенціал (D`mН+), який виникає на спряжуючій мембрані, складається з двох компонентів – електричного (різниці електричних потенціалів – DY) та осмотичного (концентраційного – DрН):

D`mН+ = DY + DрН.

Зворотний потік протонів (за градієнтом концентрації) відбувається через Н⁺–АТФ-азний комплекс. Саме цей потік протонів забезпечує синтез АТФ. Н⁺–АТФ-азний комплекс спряжуючої мембрани – це фермент АТФ-синтетаза, який складається з фактора F₁ та мембранних компонентів (комплексу F₀). Фактор F₁-мультимер з молекулярною масою 360 тис., складається з п'яти типів субодиниць – a, b, g, t, e. Основні каталітичні функції даного комплексу забезпечуються a- і b-субодиницями. На a-субодиниці локалізується активний центр фактора, а на b-субодиниці – центр зв'язування субстрату (АДФ, Ф_н). До складу комплексу F₀ входять кілька видів білків з молекулярною масою 19 – 30 тис., які забезпечують утворення протонпровідного каналу та спрямованість потоку протонів. Комплекс F₀ виконує роль рецепторної та спряжуючої ділянок ферменту, а фактор F₁ – каталітичної. Н⁺–АТФ-азний комплекс локалізується в спряжуючій мембрані мітохондрій так, що комплекс F₀ пронизує всю мембрану, а фактор F₁ – локалізується на внутрішньому боці мембрани мітохондрій (з боку матрикса). Цей комплекс нагадує грибоподібні вирости, в яких ніжка гриба пронизує товщу мембрани, а головка – локалізується на поверхні крист.

Нині існує кілька пояснень механізму спряження окислення і фосфорилювання. Суть більшості з них полягає в тому, що процес спряження здійснюється внаслідок використання енергії (D`mН+) при нагромадженні протонів (Н+) в активному центрі Н⁺–АТФ-азної системи, розміщеної у факторі F₁. Нагромадження їх призводить до активації неорганічного фосфату, утворення активного фосфорилу, зв'язаного b-субодиницею фактора F₁ внаслідок зняття з нього групи ОН та елімінації (видалення) води у матрикс. Одночасно відбувається й активація АДФ, зв'язаного з цією самою субодиницею фактора F₁ після втрати протона при взаємодії з групою ОН матрикса. Активований фосфат і АДФ, сполучаючись, утворюють молекулу АТФ. Згідно з іншою концепцією, утворення АТФ відбувається так: протони Н+ в активному центрі спряжуючого фактора активують фосфат і карбоксильну групу однієї з субодиниць фактора F₁, внаслідок чого утворюється фосфоензим з макроергічним зв'язком. При взаємодії АДФ з фосфоензимом утворюється АТФ. Існує також припущення, що роль протонів Н+ полягає у зміні конформації фактора F₁ і що саме конформаційні видозміни активного центру Н⁺–АТФ-азного комплексу є рушійною силою для синтезу АТФ.

В результаті досліджень П. Бойєра було встановлено, що швидкий і зворотний синтез АТФ може відбуватися в активному центрі АТФ-ази без затрат енергії (D`mН+). Стадією, що лімітує дану реакцію, є виділення синтезованої АТФ з активного центру ферменту в матрикс, тобто з гідрофобної фази у водну.

Саме цей процес прискорюється при енергизації мембрани. Згідно з гіпотезою П. Мітчелла, на кожній мембрані є два протони, що транспортуються по електронно-транспортнсму ланцюгу крізь мембрану, внаслідок чого синтезується одна молекула АТФ. Отже, ланцюг перенесення електронів має три протонних насоси, що відповідають трьом ділянкам спряження. Дихальний ланцюг тричі перетинає внутрішню мембрану, при цьому кожна пара електронів, що переносяться від НАД×Н₂ до кисню, виділяє три пари протонів із внутрішнього матрикса і переносить у міжмембранний простір. Цим зумовлене чергування в дихальному ланцюгу переносників протонів і електронів.

Крім окислення, спряженого з процесами фосфорилювання та синтезом АТФ, існує так зване вільне або нефосфорилююче окислення. Ферментні системи вільного окислення локалізовані на зовнішньому боці внутрішньої мембрани мітохондрій, а також на мембранах ендоплазматичного ретикулуму та інших клітинних органел. Вільне окислення, як правило, процесами фосфорилювання та спряженими з ними процесами синтезу АТФ не супроводжується. Енергія, що утворюється в процесі вільного окислення, розсіюється у вигляді теплоти. Вважають, що система дихального ланцюга, яка забезпечує фосфорилююче окислення, може переключатись на процеси вільного окислення, що відіграє важливу роль у процесах адаптації організму до умов навколишнього середовища. Зокрема, досліджено, що при охолодженні організму фосфорилююче окислення послаблюється, а вільне окислення, навпаки, посилюється. Внаслідок цього енергія окислення органічних сполук генерується на теплоту тіла, тобто в організмі існують механізми, що забезпечують зміну співвідношення між фосфорилюючим та вільним окисленням. Сполуки, що гальмують спряженість процесів окислення та фосфорилювання, називаються роз'єднуючими факторами.

У ролі роз'єднувачів можуть виступати різні метаболіти, біологічно активні сполуки, хімічні агенти, лікарські препарати тощо. Так, гормон тироксин послаблює спряженість процесів окислення і фосфорилювання, а інсулін, навпаки, посилює даний процес. У зв'язку з цим при надмірній секреції тироксину внаслідок гіперфункції щитовидної залози, як правило, спостерігається підвищення температури, хворі погано переносять тепло. Із хімічних агентів у ролі роз'єднувачів виступають такі сполуки, як динітрофенол, дикумарини та ін. Значно послаблюють спряженість процесів окислення і фосфорилювання також токсини патогенних мікроорганізмів, які викликають інфекційні захворювання, що супроводжуються підвищенням температури. За цих умов лікарські препарати, такі як ацетилсаліцилова кислота, фенацетин та інші, згубно діють на збудників захворювань і сприяють відновленню спряження між процесами окислення та фосфорилювання, в результаті чого знижується температура організму.

Зміна співвідношення між процесами фосфорилюючого та вільного окислення досить важлива для тварин, які впадають в анабіоз. Процеси життєдіяльності в цих тварин підтримуються на низькому рівні й енергетичні витрати мінімальні, тому в них процеси вільного окислення переважають над фосфорилюючим окисленням. Такі тварини мають запаси бурого жиру, що містить велику кількість мітохондрій, які спеціалізуються на продукуванні теплоти, що зігріває кров. У вигляді роз'єднувачів у даному випадку є жирні кислоти, що утворюються при розщепленні жирів і надходять у кров. Як тільки запаси жиру вичерпуються, процеси фосфорилювання поновлюються і тварини виходять з анабіозу. Це досить часто трапляється з тваринами, в яких запаси жиру недостатні, внаслідок чого стан анабіозу припиняється серед зими.

Зміна співвідношення між процесами фосфорилюючого та вільного окислення відіграє важливу роль в адаптації організмів до зміни умов навколишнього середовища. Отже, основною сполукою, що відіграє вирішальну роль в енергозабезпеченні організму, є АТФ, синтез якої здійснюється спряжено з процесами окислення в організмі. Енергія, що акумулюється в макроергічних зв'язках АТФ, може бути використана для різних потреб організму, процесів синтезу, руху, транспорту іонів, виконання роботи. Це зумовлено тим, що АТФ може виступати не лише в ролі акумулятора енергії, але і її трансформатора та донора. АТФ відіграє провідну роль в енергообміні, що пов'язано з особливостями її будови. Завдяки наявності сильного негативного заряду, за рахунок іонізованих фосфатних груп, відбувається зближення пуринового циклу з залишками фосфату. При цьому стабільна енергія, що вивільнюється під час розриву макроергічних зв'язків у молекулі АТФ, передається на пуриновий цикл і трансформується на мобільну енергію збудження електронів системи спряжених подвійних зв'язків пуринового циклу. Це викликає перехід у збуджений стан електронів хімічних сполук, що підлягають перетворенню, і надає їм підвищену реакційну здатність, створюючи потенційну можливість для зворотного перетворення мобільної енергії збуджених електронів на стабільну енергію хімічних зв'язків. Трансформація стабільної енергії фосфоангідридних зв'язків на мобільну енергію збуджених електронів пуринового циклу та зворотній процес – перетворення мобільної енергії збуджених електронів в стабільну енергію хімічних зв'язків органічних сполук є першим етапом перетворення енергії в живих системах.

При енергетичному обміні в організмі основною ланкою є аденілатна система: АТФ та продукти її гідролізу – АДФ, АМФ, Ф_н і пірофосфат. Ця система подібно до акумулятора може заряджатись енергією від певних генераторів і передавати її на інші сполуки, забезпечуючи процеси енергетичного обміну, тобто в організмі проходить постійне утворення АТФ (нагромадження енергії) та її розщеплення, що супроводжується вивільненням енергії:

АДФ + Ф_н ® АТФ; АТФ ® АДФ + Ф_н.

При гідролізі АТФ утворюються молекула АДФ і неорганічний фосфат. Рівень зміни стандартної вільної енергії при цьому становить 37 – 42 кДж/моль. Під час гідролізу кінцевої фосфатної групи АДФ спостерігається близька величина зміни рівня стандартної вільної енергії, однак АДФ не є макроергічною сполукою, оскільки виділена енергія розсіюється у вигляді теплоти. При гідролізі АМФ рівень зміни стандартної вільної енергії становить 9,6 кДж/моль, тобто АМФ і АДФ не є макроергічними сполуками.

Крім схеми, наведеної вище, гідроліз АТФ може проходити з відщепленням двох залишків фосфату:

АТФ ® АМФ + Н₄Р₂О₇

Пірофосфат, що утворюється при цьому, є макроергічною сполукою, однак його використання в обмінних процесах обмежене в зв'язку з тим, що під час гідролізу його макроергічних зв'язків вивільнюється теплова енергія.