Непрямая иммунопероксидазная реакция

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ НА ПРЕПАРАТАХ ЛИМФОЦИТОВ ТИПА

"ВЫСУШЕННОЙ КАПЛИ"

1) В градиенте фиколл-верографин выделить 0,5 млн. лейкоцитов нанести каплю (20 мкл.) на предметное стекло, осторожно поместить его на 20 мин. в бытовой холодильник при +4°С.

ВНИМАНИЕ: Стекло должно быть идеально чистым, обезжиренным и сухим. На жирных стеклах капля растекается.

2) По завершении 20 мин. остатки жидкости испарить под вентилятором при комнатной температуре, поместить на гистоло­гический планшет, закрыть и хранить до 3-х дней при +4°С, дольше - при минус 20°С, или сразу же проводить иммуно-гистохимическую реакцию. Если стекла хранились в холо­дильнике, их следует довести до комнатной температуры 20 - 30 мин.

3) Зафиксировать каплю в течение 10 мин. в парах 10%-го нейтрального формалина.

4) Промыть каплю 5раз по 100мкл. аптечного физиологического раствора, стряхнуть, «отсосать»капельки фильтровальной полоской. Следить за клетками,их можно нечаянно «отсосать».

5) Нанести 20 мклхорошо перемешанного раствора моноклонального антитела, инкубировать 1 часпри комнатной температуре под чашкойПетри, на влажной бумаге или салфетке.

6) Промыть по п. 4.

7) Нанести 20 мл. хорошо перемешанного пероксидазного конъюгата. Инкубировать по п. 5.

8) Минут за 10 до окончания инкубации (п. 7) начать готовить раствор хромогена. Ампулу с навеской (5 мг) DAB прилить 1 мл, трисбуфера (рН=7,2 – 7,4) перемешать хромогендо полногорастворения и перелить в стеклянный флакон с 4-мя мг трисбуфера, очень хорошо перемешать, добавить 50 мкл. аптечной 3%-ой перекиси водорода. Если субстрат быстро чернеет проверьте исходную концентрацию аптечной перекиси: она может быть выше, чем 3%!

9) Промыть по п.4.

10) Нанести 50 мкл. раствора хромогена и инкубировать от 1 до 10 мин. под визуальным контролем до появления окрашивания.

11) Отмыть по п. 5, слегка докрасить ядра метиловые зеленым, если необходимо. Отсосать жидкость, внести 20 мкл. 50% глицерина и учитывать реакцию (считать число желтовато-бурых клеток в попе зрения), опустив объектив микроскопа Х 90 в глицерин. Очень осторожно, если нет покровного стекла.

Табл. 8. Основные маркеры клеток иммунной системы

Антиген	Популяция	% клеток
CD2	Т- и NK-клетки	80 ± 7
CD3	Т-клетки	72 ± 7
CD4	Т-хелперы	39 ± 5
CD5	зрелые Т-клетки, В-ХЛЛ	69 ± 5
CD7	Т- и NК-клетки	75 ± 7
CD8	Т- киллеры / супрессоры	23 ± 4
CD1O	пре-В-лифоциты
CD11b	Т-супрессоры	21 ± 6
CD14	моноциты	100% моноцитов
CD16	NK- клетки	12 ± 6
CD19	В-клетки	9 ± 6
CD20	В-клетки	9 ± 6
CD2J	В-клетки	9 ± 6
CD22	В-клетки	9 ± 6
CD23	акт. В-клетки	3 ± 3
CD27	90% CD4+ и 77% CD8+ клеток	65 ± 10
CD29	часть CD4+ и CD8+ клеток	54 ± 11
CD38	В-клетки, акт. лимфоциты	23 ± 6
CD45	все лейкоциты
CD45RA	50% CD4+ клеток и 75% CD8+ клеток, NK- и В-клетки	64+10
CD50	ICAM-3, все лейкоциты
CD54	ICAM-1	22 ± 8
CD58	все лейкоциты
CD59	все лейкоциты
CD71	акт. лимфоциты
CD72	В-клетки	9 ± 6
CD75	В-клетки	9 ± 6
CD95	Активированные лимфоциты
I CD98	Активированные лимфоциты
HLA-DR	моноциты. В—клетки и активированные Т-клетки	14 ± 7

Качественные и количественные методы определения иммуноглобулинов.

Методы исследования иммуноглобулинов включают в себя определение уровня иммуноглобулинов разных классов и подклассов и антител к определенным антигенам. При оценке результатов ис­следования необходимо учитывать, что уровень иммуноглобулинов зависит от возраста. Изменение уровня имму­ноглобулинов в сыворотке может быть следствием нарушения их синтеза, катаболизма или выведения.

Электрофорез

1. Зональный электрофорез— полуколичественный метод, по­зволяющий разделить смесь белков в зависимости от их моле­кулярной массы и электрического заряда. Суть метода заклю­чается в следующем: исследуемую смесь белков на носителе (например, пластине с гелем) помещают в камеру для электро­фореза, заполненную буферным раствором и подключенную к источнику постоянного тока. При электрофорезе белков сывороткиобычно получается 5 основных полос, которые со­ответствуют фракциям альбумина, а, а₂, β- и γ -глобулинов (рис. 19). Иммуноглобулины мигрируют преимущественно во фракцию γ-глобулинов. Относительное содержание каждой фракции сывороточных белков можно оценить с помощью денситометра. С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например спино-мозговую жидкость и мочу. Этот метод позволяет оце­нить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела.

Рис. 19. Зональный электрофорез нормальной сыворотки. На электрофореграмме и денситограмме нормальной сыворотки видны пять основных по­лос, которые соответствуют альбумину, а, а₂, β- и γ - глобулинам

2. Иммуноэлектрофорез.Суть метода заключается в следую­щем: I) проводят электрофоретическое разделение белков в геле; 2) по окончании электрофореза в геле параллельно на­правлению электрофореза вырезают бороздки; 3) в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например к тяжелым или легким цепям иммуноглобулинов. Эти анти­тела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. В тех местах, где антитела связываются с белками, образуются дуги преципитации. Имму­ноэлектрофорез позволяет оценить лишь качественный со­став исследуемой смеси белков. Оценка результатов исследо­вания требует высокой квалификации. Чаще всего этот метод применяется для выявления и характеристики моноклональ­ных антител.

3. Электрофорез с иммунофиксацией.Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков сыворотки в геле с последующей инкубацией геля в присутствии антител к тяже­лым и легким цепям иммуноглобулинов. При связывании белков с антителами образуются иммунные комплексы, кото­рые можно увидеть после окрашивания. Иммунные комплексы, содержащие нормальные иммуноглобулины от­кладываются в виде широкой, размытой полосы, моноклональные — в виде более узкой и четко очерченной. Этот ме­тод также является качественным, однако более чувствителен и прост, чем иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммуно­фиксацией часто применяется в сочетании с иммуноэлектрофорезом для определения моноклональных или олигоклональных иммуноглобулинов.

Рис. 20. Иммуноэлектрофорез сыворотки здорового (3) и больного с моноклональной гаммапатией (Б), сопровождающейся повышением уровня γ - и к- цепей. Антитела к γ - и к-цепям образуют более широкие дуги преципитации с сывороткой больного, чем с сывороткой здорового (Г. Лолор, Т. Фишер, 2000).

Рис. 21. Электрофорез с иммунофиксацией (нормальная сыворотка). На полосках геля видны размытые полосы преципитации, соответствующие тяже­лым (γ, a и m) и легким (к и l) цепям иммуноглобулинов. Тяжелые и легкие цепи моноклональных иммуноглобулинов откладываются в виде более узких и чет­ко очерченных полос (на рисунке не показано). Контроль — электрофорез нор­мальной сыворотки без иммунофиксации (Г. Лолор, Т. Фишер, 2000).

Б. Двойная радиальная иммунодиффузия— полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заклю­чается в следующем: 1) в лунки, вырезанные в агаре, вносят ис­следуемую смесь антигенов и антитела с известной специфично­стью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в располо­женные вокруг нее — антигены); 2) антигены и антитела диффун­дируют по направлению друг к другу; 3) в том месте, где про­изошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос пре­ципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для вы­явления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам. Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, спе­цифичен и может использоваться при проведении массовых ис­следований.

В. Простая радиальная иммунодиффузияпозволяет количествен­ноопределить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие — стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемен­та (например, СЗ, С4, фактора В) и других белков сыворотки. Су­ществуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации — не более 3 мкг/мл. Определяя содержа­ние иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM(например, при макроглобулинемии Вальденстрема, атаксии-телеангиэктазии), уро­вень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного факторав исследуемой пробе, напротив, искусствен­но снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, со­стоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют мед­леннее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с де­фицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхож­дения,например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при ис­пользовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты.

Техника реакции: Разведение (титр) моноспецифической антисыворотки. которое обеспечивает четкое кольцо преци­питации со стандартной сывороткой, указывается предприятием-изготовителем. При этом разведение моноспецифических сывороток подбирают таким образом, чтобы с цельной стандартной англобулиновой сывороткой формировалось кольцо: диаметром 11 – 12 мм с анти-lgA-сывороткой 8 – 9 мм и анти-lgM-сывороткой – 6 – 7 мм. В каждой серии опытов стандартную моноспецифическую сыворотку с известным содержанием иммуноглобупинов испытывают в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, цельная. Приготовленный 2% агар на буфере перед опытом растапливают на кипящей бане, затем помещают в термостат при 48°С. Количество агара, необходимое для одного стекла рассчитывают таким образом, чтобы толщина застывшего слоя была 1 – 2 мм. Моноспецифические сыворотки разводят тем же буферным раствором из расчета вдвое меньше указанных титров и нагревают на водяной бане до 50°С, После этого разведения антисыворотки тщательно смешивают с агаром в равном объеме. Смесь агара с антисывороткой разливают на предварительно подогретые стекла, лежащие строго горизон­тально. После застывания агара в нем металлическим штампом с внутренним диаметром 2 мм выбивают лунки на расстоянии 1 – 1,5 см друг от друга. Четыре первые лунки заполняют сывороткой в различных разведениях (цельная, 1:2, 1:4, 1:8), в остальные вносят испытуемые сыворотки. Во избежание ошибок при учете результатов лунки заполняют очень аккуратно с помощью микрошприца или капилляра. Стекла помещают во влажную камеру при комнатной температуре. Учет результатов проводят через 24 часа для иммуноглобулинов G и А, через 48 часов для IgM.

Учет реакции: По окончании времени реакции измеряют диаметры образовавшихся колец преципитации. На графике по оси ординат откладывают квадраты радиусов колец преципи­тации, а по оси абсцисс – известное количество иммуно-глобулинов (г/л), содержащихся в эталонной сыворотке соот­ветствующего разведения. Полученные точки соединяют прямой. Содержание иммуноглобулинов в испытуемом образце опреде­ляют по построенной прямой, отдельной для каждого класса иммуноглобулинов.

Г. Нефелометрия— определение концентрации взвешенных час­тиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определе­ния концентрации антигенов, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью опре­делить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, СЗ, С4, фактора В, С-реактивного белка и некоторых других сывороточ­ных белков. Этот метод подходит для определения белков в низ­кой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода ко­личественного определения иммуноглобулинов.

Д. Радиоиммунный анализ.Этот высокочувствительный метод раз­работан более 30 лет назад и сначала использовался для опреде­ления концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он ис­пользуется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конку­рентном связывании меченного радиоактивным изотопом и не­меченого антигена с антителами. Суть метода заключается в сле­дующем: 1) известное количество антител смешивают с извест­ным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (со­держащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содер­жащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами; 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами. Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешива­ют с известным количеством стандартных меченых антител и ис­следуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке. Ос­новные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радио­активными изотопами.

Е. Твердофазный иммуноферментный анализ.В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сор­бированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбирован­ным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связыва­ются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся анти­тел и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антите­ла), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавля­ют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта фер­ментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше ме­ченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген—антитело, тем выше активность фермента и интенсив­ность окраски раствора. Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически — по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому анти­гену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену (рис. 20.5). Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным ана­лизом, но более прост, дешев и не требует применения радиоак­тивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофаз­ный иммуноферментный анализ в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

Рис. 22. Твердофазный иммуноферментный анализ. А. Определение анти­тел. Б. Определение антигенов. При радиоиммунном анализе в качестве метки используется радиоактивный изотоп, при иммунофлюоресцентном анализе — флюорохром (Г. Лолор, Т. Фишер, 2000).