Метод геномной дактилоскопии

В геноме каждого человека имеется минисателлитная ДНК. В основе её строения лежит строгая последовательность сост. из 13 нуклеотидов. Цепочка одной минисателлитной ДНК может насчитывать таких повторяющихся последовательностей от 1-ой до неск.тыс. У людей имеется 2 и более десятков минисателлитных цепочек расположенных на разных хромосомах. В совокупности они образ.набор минисателлитных ДНК различ. по длине.Для каждого человека характерен свой, присущий только ему вариант набора таких тандемно повторяющихся последовательностей отличающихся по длине.Метод анализа фрагментов минисателлитной ДНК получил название генной дактилоскопии (фингерпринт ДНК).

Технология генной дактилоскопии:сначала из каких либо клеток выделяют ДНК и с помощью рестриктаз разрезают её на фрагменты разной длины. Среди них будут те,кот. содержат вариабельные минисателлиты. Далее проводится стандартный Саузерн-блот анализ. Все полученные фрагменты подверг. электрофорезу в геле и фракции содержащие минисателлитную ДНК выявляются с помощью специального меченого зонда комплементарного к звену из 13 повторяющихся нуклеотидов. Так как зонд радиоактивен, то он засвечивает ренгеновскую плёнку только в опред. местах, давая картину из нескольких десятков чередующихся темных фракций, соответствующих отдельным минисателлитам.

Чем более родственны анализируемые особи,тем число совпадающих полос после фингерпринта ДНК будет больше и наоборот.Полностью совпадающие спектры минисателлитной ДНК выявл. только у однояйцевых близнецов.Метод фингерпринта минисателлитной ДНК обладает высокой чувствительностью и анализ можно проводить на одной капле крови или нескольких волосяных луковиц.

28Бактерии как объекты молекулярной биологии.Строение генетического аппарата…

Бактерии — домен прокариотных микроорганизмов, чаще всего одноклеточных.Изменение морфологии клеток Б. во времени даёт представление об их жизненном цикле.Многие аэробные и анаэробные Б. образ. овальные или круглые блестящие споры. Такие виды Б. наз. спороносными (или бациллами). Если споры крупные и располагаются в центре клетки, то палочка приобретает веретенообразную форму; у др. видов спора расп. на конце палочки, и тогда она приобретает форму булавы. У многих спороносных Б. диаметр споры невелик, и поэтому при образовании споры сохраняется палочковидная форма Б. В дальнейшем остатки вегетативной клетки разрушаются, и спора становится свободной. В каждой клетке образ. только одна спора и спорообразование нельзя рассматривать как размножение. Споры Б. очень устойчивы к действию высокой температуры и ядовитых в-в. Попав в благоприятную питат. среду, споры прорастают и из них выходят молодые палочковидные вегетативные клетки. Цикл развития Б. может быть различным. Так, микобактерии размножаются как делением, так и почкованием. У миксобактерий вегетативные клетки сжимаются, сокращаются и образуют круглые или овальные микроцисты, которые потом могут прорастать. Соединённые слизью микроцисты образуют тела шаровидной, грибовидной или коралловидной формы зелёного, розового или иного цвета. В процессе роста Б. могут образовывать фильтрующиеся формы, проходящие через фильтры и дающие в дальнейшем культуры, сходные или тождественные с теми, в которых они возникли.

Гены, необход. для жизнед-ти и определ. видовую специфичность, расположены у Б. чаще всего в единственной ковалентно замкнутой молекуле ДНК — хромосоме. Область, где локализована хромосома, наз. нуклеоид и не окружена мембраной. В связи с этим новосинтезированная мРНК сразу доступна для связывания с рибосомами, а транскрипция и трансляция сопряжены.Отдельная клетка может содержать лишь 80 % от суммы генов, имеющихся во всех штаммах её вида (т. н. «коллективный геном»).Помимо хромосомы, в клетках Б. находятся плазмиды — также замкнутые в кольцо ДНК, способные к независимой репликации. Они могут быть настолько велики, что становятся неотличимы от хромосомы, но содержат дополнительные гены, необходимые лишь в специфических условиях. Специальные мех-мы распределения обеспечивают сохранение плазмиды в дочерних клетках так что они теряются с частотой менее 10−7 в пересчёте на клеточный цикл. Специфичность плазмид может быть весьма разнообразной: от присутствия лишь у одного вида-хозяина до плазмиды RP4, встречающейся почти у всех грамотрицательных бактерий. В плазмидах кодируются мех-мы устойчивости к антибиотикам, разрушения специфических веществ, nif-гены, необход. для азотфиксации наход. в плазмидах.В ДНК Б. выделяются транспозоны — мобильные сегменты, способные перемещаться из одной части хромосомы к другой, или во внехромосомные ДНК.Они неспособны к автономной репликации и содержат IS-сегменты — участки, которые кодируют свой перенос внутри клетки. IS-сегмент может выступать в роли отдельной транспозоны.

29. Способы переноса генов у бактерий. Трансформация и её механизм.Трансформация- это перенос ДНК, изолированной из одних клеток в другие. При трансформации ДНК, выделенную из клеток одного штамма, поглащают клетки другого штамма – реципиента. Трансформация возможна у целого ряда бактерий Diplococcus, Hemophilus, Bacillus, а также у актиномицетов, цианобактерий. В процессе трансформации рассматривают след стадии. Для того чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находится в состояниикомпетентности. Возникновению компетентности способствует особый белок. В присутствии хлорамфеникола – ингибитора белкового синтеза – состояние компетентности не развивается. В то же время антибиотик, добавленный к компетентной культуре, компетентности не подавляет. Следовательно, белок, стимулирующий компетентность, вырабатывается в ходе роста культуры. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных клеток, затем расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов. После этого фрагменты ДНК проникают в клетку. После попадания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одноцепочечную: одна нить деградирует. На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного трансформирующего фрагмента с ДНК клетки рециниента. При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент объединяется с ДНК реципиента. Процесс трансформации завершается в течении 10-30 минут. Частота трансформации разных бактерий составляет 1%.

30. Конъюгация у бактерий и её механизм. Генетические карты бактерий и принципы их построения.

Конъюгация — перенос генетического материала от одной бактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту) при их непосредственном контакте. Процесс конъюгации у бактерий обнаружили Дж. Ледерберг и Э. Татум в 1946 г. Механизм переноса генетического материала при конъюгации из бактерии донора в бактерию реципиента показали В. Вольман и Ф. Жакоб. При конъюгации фактор F может перейти из мужской в женскую клетку и превратить ее в F4". Доноры F4" переносят довольно эффективно F-плазмиду во все клетки F~, a гены хромосомы — с низкой частотой .Половой фактор F обладает способностью включаться в геном бактерии и тогда из цитоплазматической структуры превращается в фрагмент хромосомы. Клетки, в которых возникает этот процесс, образуют Hfr-штамм. Доноры Hfr переносят бактериальную хромосому с фиксированной точки — сайта интеграции плазмиды, ориентированным образом и с высокой частотой. Интегрированный F-фактор переносится последнимПри конъюгации клетки-доноры F4" или Hfr соединяются с клетками-реципиентами F~~ при помощи конъюгационного мостика — особой протоплазматической трубки, образуемой клеткой F"1". В клетке донора Hfr под влиянием фермента эндонуклеазы в точке внедрения фактора F происходит разрыв цепи ДНК. Свободный конец одной из цепей ДНК постепенно начинает передвигаться через конъюгационный мостик в клетку реципиента (F~) и сразу же достраиваться до двухцепочной структуры. На оставшейся в клетке-доноре цепи ДНК синтезируется вторая цепь.
Так как фактор F у разных штаммов Hfr включается в хромосому и разрывает ее в разных местах, переход хромосом в реци-пиентную клетку начинается с разных участков. Для переноса всей цепи ДНК в клетку реципиента требуется при 37 °С 100 мин, но конъюгационный мостик очень хрупкий, легко разрывается, и, как правило, вся цепь не успевает перейти. Затем ДНК донора в гомологичных участках вступает в контакт с ДНК реципиента, и в результате кроссинговера некоторые участки одной цепи ДНК реципиента заменяются фрагментами ДНК донора.На основании определения времени передвижения фрагментов разной длины из клеток Hfr в клетки F~ было установлено расстояние между генами в минутах, что позволило построить карты хромосом. В основе построения карт хромосом лежат последовательность расположения генов в хромосоме и расстояние между ними в минутах.

31. Бактериофаги(БФ) как объекты МБ. Трансдукция.БФ разл. по хим. структуре, типу нукл. кислоты, морфологии и хар-ру взаимодействия с бактериями. Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2-4 р. больше диаметра головки. В головке содержится генет. материал- 1цепочечная или 2цепоч. РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окруж. белковой или липопротеиновой оболочкой- капсидом, сохраняющим геном вне клетки. НК-та и капсид вместе составляют нуклеокапсид. БФ могут иметь икосаэдральный капсид, собранный из множества копий одного или двух специфичных белков. Фаги по форме могут быть сферические, лимоновидные или плеоморфные. Хвост, или отросток, представляет собой белковую трубку- продолжение белковой оболочки головки, в основании хвоста имеется АТФаза, к-рая регенерирует энергию для инъекции генет. материала. М.б. БФ с коротким отростком, не им. отростка и нитевидные. Отросток имеет вид полой трубки, окружённой чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда вирусов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется базальная пластинка, от которой отходят тонкие длинные нити, способствующие прикреплению фага к бактерии. Общее количество белка в частице фага — 50—60%, нуклеиновых кислот — 40—50%. Фаги, как и все вирусы, являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Жизненный цикл.Умеренные и вирулентные БФ на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл:

· Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.

· Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.

· Совместная репликация фаговой и бактериальной НК-ты.

· Деление клетки.

· Далее БФ может развиваться по лизогенном либо литическ. пути.

Умеренные БФ после деления клетки нах. в состоянии профага (Лизогенный путь). Вирулентные БФ развиваются по Литической модели:

· НК-та фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка.

· НК-та фага реплицируется и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в рез-те спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой НК-ты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим.

· Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200—1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.

Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи БФ. Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер.
Общая, или неспециф., трансдукция. Трансдукцию осуществляют умеренные БФ. Осуществляется фагом P1, существующим в бактериальной клетке в виде плазмиды, фагами P22 и Mu, встраивающимися в любой участок бактериальной хромосомы. После индуцирования профага возможна ошибочная упаковка фрагмента ДНК бактерии в капсид фага, ДНК самого фага в нём в этом случае нет. Длина этого фрагмента равна длине нормальной фаговой ДНК, его происхождение может быть любым: случайный участок хромосомы, плазмида, другие умеренные фаги. Попадая в другую бактериальную клетку, фрагмент ДНК может включаться в её геном, обычно путём гомологичной рекомбинации. Перенесённые фагом плазмиды способны замыкаться в кольцо и реплицироваться уже в новой клетке. В ряде случаев фрагмент ДНК не встраивается в хромосому реципиента, не реплицируется, но сохраняется в клетке и транскрибируется. Это явление носит название абортивной трансдукции. Специфическая трансдукция. Наиболее хорошо изучена на примере фага λ. Этот фаг встраивается только в один участок (att-сайт) хромосомы E. coli с определённой послед-стью нуклеотидов (гомологичной att-участку в ДНК фага). Во время индукции его исключение может пройти с ошибкой (вероятность 10−3—10−5 на клетку): вырезается фрагмент тех же размеров что и ДНК фага, но с началом не в том месте. При этом часть генов фага теряется, а часть генов E. coli захватывается им. Вероятность переноса гена в этом случае падает при увеличении расстояния от него до att-сайта. Для каждого специфически встраивающегося в хромосому умеренного фага характерен свой att-сайт и, соответственно, расположенные рядом с ним гены, которые он способен передавать. Ряд фагов может встраиваться в любое место на хромосоме и переносить любые гены по механизму специфической трансдукции. Кроме того, в хромосоме обычно есть последовательности, частично гомологичные att-участку ДНК фага. При повреждении полностью гомологичного att-сайта можно добиться включения фага в хромосому по этим последовательностям и передачу в ходе специфической трансдукции генов, соседних уже с ними. Когда умеренный фаг, несущий бактериальные гены, встраивается в хромосому новой бактерии-хозяина, она содержит уже два одинаковых гена — собственный и принесённый извне. Поскольку фаг лишён части собственных генов, часто он не может индуцироваться и размножиться. Однако при заражении этой же клетки «вспомогательным» фагом того же вида, индуцирование дефектного фага становится возможным. Из хромосомы выходят и реплицируются как ДНК нормального «вспомогательного» фага, так и ДНК дефектного, вместе с переносимыми им бактериальными генами. Поэтому около 50% образующихся фаговых частиц несут бактериальную ДНК. Это явление носит название трансдукции с высокой частотой.

32. Генная инженерия, её задачи, теоретические предпосылки, история зарождения, основные достижения. Инструментарий генной инженерии.ГИ – это совокупность методов, позволяющих посредством операций in vitro (в пробирке, вне организма), переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Цель ГИ в получении клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые “человеческие” белки; в возможности преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (использование в селекции растений, животных). Группой исследователей П. Бергом создание в 1972г. вне организма первой рекомбинантной ДНК (гибридной) - состояла из фрагментов кишечной Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии суть методов заключается во введении в организм нового гена с помощью вектора, т.е. устройства для доставки нового гена в клетку (используют плазмиды - кольцевой двухцепочечной молекула ДНК, которая есть в бактериальной клетке. Плазмиды несут жизненно важные для бактерии гены – гены лекарственной устойчивости к антибактериальным препаратам. Бактерия, имеющая различные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. Наиболее распространенными методом ГИ является метод конструирования и переноса рекомбинантных ДНК. Этот метод включает несколько этапов: Создание вектора - состоит из двух последовательных стадий: рестрикции и лигирования.Трансформация – введение. 3. Скрининг – отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека. Их отбирают, размножают (клонируют), так как они способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном. С начала 80-х годов получено множество геномодифицированных сортов зерновых культур Выведены невиданные раньше сорта картофеля, кукурузы, сои, риса, рапса, огурцов.