Питательные среды
Питательные среды - это искусственно приготовленный комплекс питательных веществ, предназначенный для культивирования микроорганизмов. Это искусственно приготовленная среда обитания микробов. Такие питательные среды обычно готовят на определенной основе (агар, мясо-пептонный бульон и пр.), с учетом пищевых потребностей культивируемых на них микробов. Они бывают простого и сложного состава и готовятся для лабораторных или промышленных целей.
Питательные среды должны:
1. Содержать в нужном количестве весь набор элементов, которые предназначены для восполнения структуры микроорганизмов. Они должны быть в усвояемых химических соединениях:многоатомные спирты, углеводы, органические кислоты и пр. - это источники углерода; аммонийные соединения, аминокислоты, белки, пептиды - источники азота;соли фосфорной и др. кислот - источники микроэлементов;витамины и др. - факторы роста,а также должны содержать соли, воду.
2. Иметь оптимальную: влажность (не мене 20 % воды), вязкость, рН среды (диапазон от 4,5 до 8,5), изотоничность (для большинства - 0,85 %, для голофилов - 3 %), окислительно-восстановительный потенциал Rh (для анаэробов 0,120-0,060, для аэробов более 0,90).
3. Питательная среда должна быть прозрачной.
4. Питательная среда должна быть стерильной.
Питательные среды по консистенции могут быть жидкие и полужидкие (0,3-0,7 % агара) и плотные (1,5-2,0 % агара).
Для приготовления питательных сред применяют естественные продукты животного, яичного, рыбного и растительного происхождения или искусственные ингредиенты в строго определенных количествах и такие среды называют синтетическими, а при добавлении к ним еще и естественных продуктов - полусинтетическими. Питательные среды из естественных продуктов имеют неопределенный химический состав и требуют добавок некоторых веществ - ингибиторов посторонней флоры и пр. В состав питательных сред на синтетической основе входят аминокислоты, витамины, минеральные соли и др. известные химические элементы в известных количествах. В полусинтетические среды кроме известных элементов входят пептон, дрожжевой экстракт и др. вещества.
Питательные среды по назначению бывают: консервирующие, обогащения, элективно-диагностические, универсальные и дифференциально-диагностические.
Консервирующие или транспортные среды предназначены для транспортировки в баклабораторию материала первично засеянного у постели больного.
Универсальные среды предназначены для роста неприхотливых микробов или добавки таких сред как основы к более сложным.
Среды обогащения предназначены для накопления одних микробов при подавлении роста других, что бывает очень важным, т.к. первичный материал часто засевают на твердые среды и обогащения одновременно.
Элективно-диагностические среды предназначены для первичного выделения групп или родов микроорганизма с целью последующей дифференцировки и идентификации на других средах.
Дифференциально-диагностические среды предназначены для окончательного ответа о виде и подвиде выделенной чистой культуры.
Элективность диагностических сред выделения бактерий достигается за счет добавления в их состав определенных ингибиторов для других видов микроорганизмов (желчь, азид натрия, теллурит калия, рН, соль, антибиотики и др. вещества). Проводимая далее с чистой культурой дифференциальная диагностика бактерий основана на определении особенностей, например, биохимических и др., путем внесения в среду определенных субстратов (сорбита, мальтозы, сахарозы и др. - это углеводы; орнитина, лизина, аргинина и др. – это белки; солей, мочевины и пр.).
В настоящее время на разные группы микробов выпускают в стране и за рубежом тесты нескольких поколений и порядков: 1-порядка - тест-система, расфасованная по лункам полистироловых пластин питательная среда (АР1-20E, Eneroes, MMТE1 и др.). 2-порядка - системы в бумажном индикаторном исполнении (Micro-10, M:N:ТEK и др.), 3 -порядка - тест-система жидкая, приготовленная ex тempore.
Приготовление питательных сред
Ввиду множества прописей приготовления питательных сред, в этом разделе приводим примеры приготовления наиболее распространенных из питательных сред.
Компоненты для питательных сред. Натуральные питательные среды целиком состоят из животного сырья (свернутая сыворотка, кровь и др.) или с наполнителем (агар, пептон, желатин и др.). Для питательных сред используют:картофель,кровь, молоко, яйца, рыбную муку, дрожжи и пр. и готовят из них экстракты и настои (полуфабрикаты, гидролизаты и перевары, например, Хоттингера) и пр. Это источники белковых, азотистых и др. веществ. В качестве минеральных солей используют:NaCI, KHPO4, MgSO4 и др. В качестве сахара – глюкозу либо лактозу, мальтозу, сахарозу и пр. Из индикаторов применяют Андреде (0,5 г кислый фуксин, 1N NaOH 17 мл, дистиллированная вода до 100 мл), Кларка (1,5 % раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.), а также нужно использовать аминокислоты, витамины и др. ингредиенты.
Для искусственных сред применяют определенные элементы в строго известных дозах, которые оптимальны для конкретных микроорганизмов.
Некоторые рецепты приготовления питательных сред:
Транспортные среды.
1. Среда с теллуритом калия. Агаровую основу 0,1 % разливают в пробирки по 4 мл. Стерилизуют при 1 атм 20 мин. В каждую пробирку по правилам асептики вносят 0,5-1,0 мл сыворотки КРС и по 0,05 мл 2 % раствора теллурита калия. Срок хранения 10 дней.
2. Среда Тига (глицериновая смесь). Смешивают 1 л глицерина и 2 л 0,85 % раствора хлорида натрия и 15-20 % раствора фосфата натрия в количестве, чтобы рН был 7,8-8,0. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или 20 мин при 0,5 атм.
3. Глицериновый консервант. Это разновидность глицериновой смеси, с содержанием солей лития.
Среды обогащения.
1. Селенитовая среда. Смешивают пептон- 0,5 г, селенистокислого натрия - 0,4 г, фосфата натрия однозамещенного - 0,7 г, фосфорнокислого двузамещенного натрия - 0,7 г, лактозы - 0,4 г, дистиллированной воды - до 100 мл. Разливают по пробиркам и флаконам, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
2. Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, наливают 90 мл бульона и стерилизуют 30 мин при 1 атм. К каждому флакону в асептических условиях добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора гупосульфита натрия.
Раствор Люголя:дистиллированная вода 20 мл, йодида калия 20 г, йода 25 г. После растворения доливают дистиллированной воды до 100 мл. Раствор гипосульфита натрия:в мерный цилиндр насыпают 50 г гипосульфита натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл, перемешивают, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.
Универсальные среды.
1. Мясо-пептонный бульон.
а) Приготовление мясного экстракта:
500 г мяса (без костей, жира и сухожилий) разрезают на мелкие кусочки (пропускают через мясорубку), заливают 1 л водопроводной воды. Выдерживают сутки в холодильнике или 2 ч в термостате при 370 С. Отжимают мясо через марлю, кипятят на огне 5 мин и дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема
б). Приготовление мясопептонного бульона:
В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г (1 %) пептона и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают слабощелочную реакцию 10 % раствором соды с помощью лакмуса (красная лакмусовая бумага слегка синеет). Кипятят 30-40 мин на огне. Дают остыть, фильтруют через бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Определяют концентрацию водородных ионов калориметрическим путем - в компараторах, подправляют рН 10 % раствором щелочи или уксусной кислоты. Кипятят, остужают, фильтруют, разливают по 5-6 мл в пробирки и по 50-100 мл в колбы, стерилизуют до 20 мин в автоклаве при 120о С.
2. Приготовление мясопептонного агара:
К бульону прибавляют 2- 3 % измельченного агара, нагревают до растворения агара, остужают агар до 500 С. Для осветления вносят белок 1 куриного яйца, смешивают его с двойным объемом холодной воды и вносят в агар, автоклавируют 45 мин при 1150 С для осаждения хлопьев белка. Фильтруют агар еще не остывший, разливают в стеклянную посуду. Вновь стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1200 С. Готовят скошенный или прямой агар, остужая пробирки (флаконы, колбы) до застывания агара.
3. Приготовление перевара (гидролизат) Хоттингера:
а) Мясо (1 кг) нарезают кусочками, добавляют двойной объем воды и кипятят 15-20 мин, извлекают, пропускают через мясорубку и опускают снова в тот же бульон, подщелочив его до рН 8,0. Охлаждают до 400 С, добавляют поджелудочную железу, пропущенную через мясорубку, в объем 100 г на 1 л воды.
б) Фарш перемешивают, подщелачивают, переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой, оставляют треть бутылки свободной. Вносят 1-3 % хлороформа, закрывают бутыль, встряхивают, открывают бутыль на 1 мин для выпускания хлороформа
в) Проверяют рН (через 1 ч после добавления фермента) и подщелачивают до рН 7,4-7,6. Смесь оставляют на 10-16 дней при комнатной температуре. Первые дни подщелачивают и встряхивают. За несколько дней до окончания экспозиции бутыль не встряхивать.
г) Правильный перевар будет иметь пылевидный осадок и соломенно-желтый раствор. Содержание азота 11,00-12,00 г на 1 л. Перевар фильтруют через полотнянный фильтр или бумажный, разливают в бутыли и колбы и стерилизуют в течение 30 мин при 1200 С.
4. Приготовление бульона Хоттингера:
К 100 мл перевара Хоттингера добавляют 800 мл дистиллированной воды, вносят 5 г хлористого натрия, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают рН 7,4-7,6. Разливают в колбы и пробирки. Стерилизуют в течение 20 мин при 1200 С. Содержание аминного азота - 1,00-1,20 г на 1 л.
5.Приготовление агара Хоттингера:
К 1 л бульона Хоттингера в колбе объемом 2-3- л прибавляют 18-25 г мелко нарезанного агара (1,5-2,0 %). Будьон кипятят, постоянно его перемешивая, до расплавления агара. Устанавливают рН 7,4-7,6 . Расплавленный агар фильтруют через несколько слоев марли и разливают в колбы и пробирки. Посуду расставляют в специальную тару и стерилизуют в течение 20 мин при 1200 С в стерилизаторе. Затем стерильный агар в посуде используют для посева микроорганизмов или расплавляют, разливают в более мелкую посуду и вновь стерилизуют.
Элективно-диагностические среды.
1.Пептонная вода:
В воду добавляют 1 % пептона (1 г на 100 мл воды), устанавливают рН 8,0, разливают по 15 мл в пробирки, стерилизуют 20 мин при 1200 С. Среда предназначена для роста холерных вибрионов, при ингибиции остальных бактерий.