Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene

Представлена робота є початковим етапом дослідження взаємодій між учасником mTOR-сигнального шляху білком NPRL2 та комплексом білків, які відіграють важливу роль на дорибосомальному етапі біосинтезу білка — аміноацил-тРНК-синтетазами. Так, як і досі вчені не дійшли одностайної думки щодо неканонічних функцій мультисинтетазного комплексу, є важливим пошук нових партнерів, що, можливо, проллє світло на багато фундаментальних процесів у клітині.

Група вчених із Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) під керівництвом доктора Наойї Фуджіти досліджує білок NPRL2 та його участь у канцерогенезі. У одному зі своїх експериментів вони ідентифікували як партнера вище згаданого білка макромолекулярний комплекс аміноацил-тРНК-синтетаз. Метою нашої роботи було визначити, з якими саме компонентами взаємодіє NPRL2 та які наслідки цієї взаємодії. Тому завданнями були: отримати рекомбінантний білок NPRL2 з міткою Flag та компоненти MARS комплексу, виділені із культури клітин людини; імунопреципітувати білок NPRL2 на матрикс, що містить антитіла до мітки Flag; перевірити наявність білків-партнерів у елюаті з афінного матриксу. У рамках експерименту було проведено котрансфекції із кожним компонентом комплексу MARS, проте лише для п'яти було отримано дані, які підлягають інтерпритації.

Для перевірки взаємодій між екзогенним білком NPRL2 та мультисинтетазним комплексом було вирішено обрати лінію клітин, у якій не експресується ген TUSC4. Цьому параметру відповідає клітинна лінія HeLa, отримана із ракової пухлини (карциноми) шийки матки. За результатами деяких досліджень, ця клітинна лінія містить делецію у ділянці 3.16р, а тому можна буде точніше оцінити взаємодію між екзогенними білками. Шляхом культивування різної кількості клітин (0,1 млн, 0,2 млн та 0,3 млн) на чашках з площею дна 9,6 см² було визначено, що оптимальну конфлюентність на день експерименту мають культури з початковою кількістю клітин у 0,2 млн.

Effectene — неліпосомний ліпідний реагент для ДНК трансфекції широкого спектру клітинних ліній. Даний реагент було обрано через такі його властивості, як висока ефективність трансфекції у середовищі із сироваткою крові та при малій кількості ДНК, низька цитотоксичність.

Для ефективної трансфекції важливими характеристами є тип промотора, під контроль якого клоновано цільовий ген, відношення між кількістю плазмід, які використовуються для котрансфекції та відношення загальної кількості ДНК до об'єму реагенту для трансфекції, які підбираються експериментальним шляхом. Для визначення оптимальних умов були використані плазміди pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6. Перша конструкція кодує NPRL2 із міткою Flag, друга — глутаміл-проліл-тРНК-синтетазу із полігістидиновою міткою. Згідно з інструкцією до реагенту, було протестовано такі умови на культурах клітин HeLa кількістю 0,2 млн у одній чашці :

· відношення кількості ДНК до об'єму Effectene — 1 мкг/25 мкл (Рис. 4.1, доріжка 1), 1мкг/12,5 мкл (Рис. 4.1, доріжка 2), 1 мкг/6,75 мкл (Рис. 4.1, доріжка 3) за умов відношення кількості плазмід 1:1;

· відношення кількості плазміди pc5FLAG/TUSC4 до іншої, що кодує EPRS-H6 — 1:1 (Рис. 4.1, доріжка 2), 1:2 (Рис. 4.1, доріжка 4), 1:3 (Рис. 4.1, доріжка 5) за умов відношення кількості ДНК до кількості реагенту — 1мкг/12,5 мкл.

Перевірка ефективності умов показала, що найбільш оптимальними є відношення кількості плазмід 1:1 та відношення ДНК до об'єму реагенту для трансфекції — 1мкг/6,75 мкл (Рис 4.1), які і використовувались на початковому етапі. У ході експерименту відношення між кількостями плазмід змінювалось відповідно до результатів, отриманих за початкових умов.

Рис. 4.1. Імуноблотограми екстрактів загальних фракцій білків культур клітин HeLa, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6, інкубованих з Anti-Flag M2 антитілами (А) та Anti-R3 CHO_3bleeding антитілами (Б)