Регуляция активности ферментов

Изучение аллостерических свойств а-амилазы

Принцип метода. Некоторые лекарственные препараты и хлориды металлов могут оказывать аллостерическое влияние на активность амилазы. Активность амилаза определяется фотометрически по уменьшению количества крахмала в ходе его гидролиза под действием амилазы. Крахмал выявляется в цветной реакции с йодом. Для создания среды, оптимальной для работы фермента, используется фосфатный буфер рН 7,2.

Ход работы.

1). Приготовление раствора амилазы. Собирают в пробирку 0.5 мл не разведенной слюны, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой и тщательно перемешивают содержимое пробирки.

2). Приготовление раствора лекарственного препарата. Таблетку растирают в ступке, порошок растворяют в буфере и количественно переносят в мерную колбу объемом 100 мл, объем жидкости доводят до метки буфером.

3). Инкубация амилазы с лекарственным препаратом: берут 2 стаканчика и смешивают растворы:

1 стаканчик - 1 мл амилазы в 1 мл буфера;

2 стаканчик - 1 мл амилазы и 1 мл раствора лекарственного препарата.

Инкубируют 15 минут при 37°С (термостат).

4). Определение активности амилазы. Берут 3 пробирки и вносят следующие растворы:

1 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №1;

2 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №2;

3 пробирка - 0,05 мл буфера.

Во все пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала, хорошо перемешивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. После инкубации в каждую пробирку вносят 1 мл раствора йода и 8 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивают и немедленно измеряют светопоглощение против дистиллированной воды на фотоэлектроколориметре, светофильтр №8, кювета с толщиной слоя 1 см. Записывают величину экстинкции для каждой пробирки (Е₁,Е₂,Е₃).

5). Расчет активности амилазы. Активность амилазы выражают в граммах крахмала, расщепленного 1 литром слюны за 1 час инкубации при 37°С. активность амилазы без лекарственного вещества – А₁:

А₁=(Е₃-Е₁)/Е3*80 г/(л*час)

Активность амилазы в присутствии лекарственного вещества - А₂:

А₂=(Е₃-Е₂)/Е3*80 г/(л*час)

Сравнивая величины А₁ и А₃, можно сделать вывод о наличии аллостерических влияний на активность амилазы и их направленности.

Результат: ___________________________________________________________________

_______________________________________

Е1=_________________________

Е2=_________________________

Е3=_________________________

А1=_________________________

А2=_________________________

Вывод_______

____________________________________________________

Лабораторная работа № 7

Количественное определение активности фермента

Действие амилазы на крахмал

Принцип метода. Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала (гликогена) через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, а затем глюкозы.

(С₆Н₁₀О₅)n→(С₆Н₁₀О₅)х→y С₁₂Н₂₂О₁₁→n С₆Н₁₂О₆

Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску или вообще не окрашиваются.

Поэтому, если к раствору крахмала прибавить раствор слюны и через определенные промежутки времени добавлять в пробы 1% раствор йода, то жидкость сначала приобретает синий цвет, а затем — фиолетовый, красный, оранжевый и желтый. Это объясняется тем, что амилаза слюны расщепляет крахмал, образуя ряд промежуточных продуктов. Амилодекстрины и эритродекстрины дают с йодом гамму цветов—от фиолетового до оранжевого. Мальтодекстрины и мальтоза окрашивания с йодом не дают.

Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — могут быть обнаружены реакцией Троммера

Ход работы. Сначала готовят раствор амилазы. Для этого собирают небольшое количество слюды (примерно 0,5 мл) и разводят ее дистиллированной, водой. Разведенную слюну используют в качестве источника амилазы. Далее берут 7 пробирок.

В каждую пробирку наливают из бюретки по 1 мл раствора крахмала и добавляют по 1 мл раствора слюны. Затем в пробирки с интервалами по 5 минут добавляют по 1-2 капле раствора Люголя (содержит йод). Пробирки встряхивают, отмечают цвет раствора.

Результат: