Осаждение белков при нагревании

Ход работы. В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1%-го раствора яичного белка.

Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора).

К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1%-го раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопьевидного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии.

К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.

К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка.

К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10%-го раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается.

Б. Обратимое осаждение белков (высаливание)

При добавлении к водным растворам белков сульфатов или хлоридов щелочных и щелочноземельных металлов (Na₂SO₄, NaCl, MgSO₄ и др.) происходят дегидратация и нейтрализация белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без изменения нативной структуры. Такой тип осаждения белков называется высаливанием. Высаливание - обратимый процесс, и после удаления соли (разбавле-нием водой, диализом) белок вновь приобретает природные свойства. Поскольку разные белки высаливаются при различных концентрациях солей, этот метод используется для фракционирования белков. Для разделения белков методом высаливания широко применяется сульфат аммония.

Фракционное осаждение белков плазмы крови

сульфатом аммония

Принцип метода. Фибриноген выпадает в осадок при 33%-м насыщении плазмы сернокислым аммонием, глобулины - при полу-насыщении, а альбумины - при полном насыщении.

Ход работы

1. К 2 мл плазмы крови (для измерения объёмов жидкостей в данном опыте используют мерные пробирки) добавляют 5 мл дистил-лированной воды, 3,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадает фибриноген (можно наблюдать лишь незначительное помутнение), который отделяют фильтрованием. Наличие белка на фильтре проверяют биуретовой реакцией: для этого воронку с фильтром переносят в чистую пробирку и на фильтр наливают 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Фильтрат (№ 1) используют для дальнейшей работы.

2. К 4 мл фильтрата № 1 добавляют 4 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадают глобулины, которые отделяют фильтрованием. Получают осадок, с которым проделывают биуретовую реакцию, и фильтрат № 2.

3. К фильтрату № 2 добавляют при постоянном перемешивании стеклянной палочкой кристаллический сульфат аммония до насыщения (пока соль не перестанет растворяться). Выпадают в осадок альбумины, наличие которых проверяют биуретовой реакцией: 1 мл смеси переносят в чистую пробирку, добавляют 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди.

4. Оставшийся фильтрат № 2 используют для доказательства обратмости процессов высаливания. Для этого в насыщенный раствор фильтрата № 2 добавляют дистиллированную воду до полного растворения осадка. Для сравнения такой же опыт проделывают с пробиркой, в которой белок был осажден трихлоруксусной кислотой (см. выше). Сравнивают результаты и делают выводы.

Выводы:

Техника безопасности

Ø Соблюдайте особую осторожность при работе с концентри-рованными кислотами, с раствором трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот, с 10%-м раствором щелочи.

Ø Будьте внимательны при нагревании растворов.