Пәні бойынша Exam тапсырмасының сұрақтары

1. Молекулалықбиоинженериянегіздеріне сипаттама беріңіз.

Молекулалық бионженерия – Қазақстандағы бірден бір, ТМД елдері мен бүкіл дүние жүзіне танымал молекулалық биология, молекулалық генетика мен биоинженерия бойынша жетекші орталық. Негізгі ғылыми бағыттар бойынша жүргізілген зерттеулер қазірдің өзінде мед. мен ауыл шаруашылығында кеңінен қолданылуда. Белок биосинтезін молекулалық реттеу механизмдері саласында дүние жүзінде теңдесі жоқ нәтижелер алынды. Тұңғыш рет жоғары сатыдағы өсімдіктерде рибонуклеопротеидті бөлшектер – информосомдардың барлық кластары ашылып сипатталды; олардың биогенезі және өсімдіктің эмбриогенезі мен дамуы барысында ақуыздың биосинтездік реттелуге қатысуы зерттелді; белсенді қызмет атқаратын гетерологиялық гибрид (будан) рибосомалар жасалды. Трансляцияларды қоздыру факторлары деңгейінде белоктің биосинтездік реттелуін зерттеу негізінде жануарлар мен өсімдіктер арасындағы елеулі айырмашылықтар анықталды. Қазақстан ғалымдары ашып, жеке зерттеу бағытына айналған өсімдіктекті төменгі молекулалы қоспалар – жоғары сатыдағы өсімдіктер геномы экспрессиясын биореттеуіштерін зерттеу басқа ғыл. мекемелерде дамытылды. қазіргі Қазақстан аумағын қоныстанған халықтардың этногенезі мен этн. тарихы мәселелерін зерттеуге мүмкіндік берді. Қазіргі заманғы биология ғылымының жаңа бағыты – компьютерлік генетика мен биоинформатика дамыды, соның нәтижесінде фитопатогенез бен тұқым қуалайтын ауруларға төзімділікті туғызатын ДНҚ тізбектері мен гендер іздестірілді. Қатерлі ісікке қарсы табиғи иммунитеттің реттелуі туралы жаңа түсініктер теория жүзінде және эксперименттік негізде дәлелденді; микробтық және жануартекті ақуызды антигендерге гибридомды технология әдісін қолдану арқылы алынған моноклоналды антиденелер негізінде медицина мен эксперименттік биология қажеттіліктеріне арналған диагностикалық тест жүйелері құрылды. Дақыл клеткаларын патогендерге төзімді бидайды сұрыптауға қолдану мүмкіндігі негізделіп, бидай мен жүгерінің генетикалық өзгеруін ұдайы өсірудің тиімді жүйесі құрылған. Алғаш рет бидай мен картоптың іn vіtro клеткалары негізінде құрылған космостық биология мен биотехнология жөнінен бірегей бағдарлама жасалып, оны «Мир» ғарыш кемесінде 1991–2000 жылы ғарышкерлер Т.О.Әубәкіров пен Т.А.Мұсабаев, бірқатар ресейлік экипаждар орындады, ал 2001 жылы жаңа халықаралық ғарыш станциясында Мұсабаев өзінің үшінші сапарында алынған нәтижелерді тағы да тексерілген болатын.

2. Молекулалық биология және молекулалық генетика негіздеріне сипаттама беріңіз.

Молекулалық биология – тіршілік құбылыстарының молекулалық негіздері туралы ғылым; генетика, биохимия және биофизика ғылымдарымен тығыз байланысты. Медицина (вирусология, иммунология, онкология, т.б.), а. ш. (жануарлар мен өсімдіктердің тұқым қуалау қасиеттерін белгілі бағытта қадағалай отырып зерттеу) және биотехнология (гендік инженерия, клеткалық инженерия) салаларының теориялық негізі. Негізгі мақсаты – биологиялық ірі молекулалар (ақуыздар, нуклеин қышқылдары) құрылымын барлық деңгейде зерттеу. Өсімдік клеткасындағы информосомалар, яғни, бос цитоплазмалық, полисомды-байланысқан және ядролы ақуыздардың (РНҚ-ны қоса) және төменгі молекулалы РНҚ-ның физика-химиялық қасиеттері зерттеліп, олардың өсімдік эмбриогенезі мен дамуы кезінде белок биосинтезі мен биогенезін реттеуге қатысатыны анықталды. Соның нәтижесінде функционалды белсенді әркелкі (гетерогалды) будан рибосомалары құрастырылды. Бұрын белгісіз болып келген өсімдік клеткаларындағы (қалыпты және стресс жағдайында) зат алмасу процесінің маңызды бөліктеріндегі (азотты, көмір сулы, фенолды) ферментті кешендердің реттелу механизмі ашылды. Бұл техникалық және астық дақылдарының бағалы шаруашылық белгілерін қалыптастыру бағытының ғылыми негізін салуға мүмкіндік берді. . Азот алмасу кезіндегі маңызды ферменті – НАДФ-ГДГ-ны (никотинамидадениндинуклеотидфосфат-глютаматдегидрогенез) активациялаудың жаңа жолы анықталды. Қазақстан өсімдіктерінен жасалынған биологиялық активті заттардың биотехнологиясы жетілдірілді. Қазір республикада молекулалық биология саласы бойынша: геномды құрастыру, экспрессиясы және оның реттелуі, клетканың маңызды полимерлері белок пен нуклеин қышқылының құрылымы мен қызметі, өсімдіктердің гендік инженериясы, молекулалық иммунология мәселелері зерттелуде.

Молекулалық генетика - организмдердің өзгергіштік және тұқым қуалау қасиеттерінің молекулалық негізін зерттейді. Молекулалық генетика XX ғасырдың 40 – 50-жылдарында генетикалық мәселелерді шешуде физика мен химия ғылымдарының жетістіктерін пайдаланудың нәтижесінде пайда болды.Молекулалық генетиканың ең негізгі жетістіктері – геннің химиялық құрылымының анықталуы (1953), организмнің тұқым қуалау ақпаратының

қолдануы мен оны жазылу әдісін талдау, гендік инженерия әдістерін зерттеу болып

табылады. Қазақстанда алғаш рет эукариоттардағы генетиканың тұрақсыздық мәселесі – генетика саласының классикалық объектісі дрозофила (Drоsophіla) шыбынында қарастырылатын жаңа ғылыми бағыт дамыды, яғни молекуллық генетика. Молекула генетика лабораториясында дрозофила шыбынының бірегей коллекциясы құрылып, осы коллекцияның негізінде молекула-генетикалық ғылыми-зерттеу жұмыстары жүргізіледі және жоғары оқу орындарында кеңінен қолданылады. жалпы генетиканың үш ірі тарауы бойынша зерттеу жұмыстарын жүргізеді. Олар мутагенез, даму генетикасы және жалпы цитогенетика. Экологиялық бағыт бойынша зерттеулер де – радиацияның және өндіріс химикаттарының зардаптарын тартқан адамдардың перифериялық қан үлгілері, ДНК молекуласы мен сұйық азотта сақталып жатқан лимфоциттерін қолдана отырып адам организміне антропогендік факторлардың әсерлерін гендік, хромосомалық және популяциялық деңгейлерде зерттеудің кешенді технологиясы жүргізілуде. Drоsophіla melanogaster-ге және адам клеткаларына генетикалық әсерін салыстырмалы талдау әдісін қолданып, тұмау вирусының мутагендік потенциалы зерттелді

3. Гендік инженерияның негізгі принциптерін көрсетіңіз.

Гендік инженерия — функциональдық активті генетикалық құрылымдарды рекомбинаттық (ата-ана екі ДНК молекулалары арасынан пайда болған будан) ДНК молекулалары түрінде қолдан құрастыру. Гендік инженерияның мәні жеке гендерді бір организмнен алып, басқа организмге көшіріп орналастыру және сонымен қатар генетикалық және биохимиялық әдістердің көмегімен түраралық кедергілері жоқ, тұқым қуалайтын қасиеттері өзгеше, табиғатта кездеспейтін жаңа гендер алу; молек. биологияның бір саласы. Гендік инженерия әр түрлі организмдер геномының бөлігінен рекомбинатты ДНҚ құрастырумен қатар, ол рекомбинатты молекулаларды басқа ағза геномына енгізіп, жұмыс істеуін (экспрессиясын) қамтамасыз етеді. Гендік инженериядағы тұңғыш тәжірибені 1972 ж. американ биохимигі Т. Берг (Нобель сыйл. лауреаты) іске асырды. Ол маймылдың онноген вирусы SV-40-тың толық геномын, бактериофаг — L геномының бір бөлігін және Е. Colі бактериясының галактоза генін біріктіру арқылы рекомбинантты (гибридті) ДНҚ алды. 1973 — 74 ж. Америка биохимиктері С. Коэн, Г. Бойер, т.б. түрлі ағзалардан бөліп алынған генді бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Бұл тәжірибе басқа организмдер гендерінің жаңа ағза ішінде жұмыс істей алатынын дәлелдеді. Жануарлар клеткаларымен жүргізілген тәжірибелерде бір клетканың ядросын екіншісімен алмастыруға, екі немесе бірнеше эмбриондарды қосып біріктіруге, оларды бірнеше бөлікке бөлшектеуге болатыны анықталды. Мыс., генотиптері әр түрлі тіндердің клеткаларын біріктіру арқылы тышқанның аллофенді особьтары (фенотипі әр түрлі дарабастар) алынды. Гендік инженерия-ның теориялық негізіне генетикалық кодтың әмбебаптылығы жатады. Бір ғана кодтың (триплиттің) әр түрлі ағзадағы белок молекулаларының құрамына енетін амин қышқылдарын бақылай алатындығына байланысты, ДНҚ молекуласының кез келген бөлігін басқа бөтен клеткаға апарып салу, яғни молек. деңгейде будандастырылу теориялық тұрғыдан алғанда мүмкін екені анықталды. Жануарлар, өсімдіктер және микроорганизмдер гендерінің қызметін қолдан басқаруға болатындығы дәлелденді. Гендік (генетикалық) инженерияны – молекулалық және клеткалық инженерия белгілі бір мақсатпен жасанды айқын қасиеттері бар генетикалық материалдарды алдын ала құрастырып, оларды басқа клеткаға енгізіп, көбейтіп, зат алмасу процесін өзгеше жүргізу. Бұл әдіспен организмдердегі тұқым қуалайтын информацияны көздеген мақсатқа сай өзгертіп, олардың геномдарын белгілеген жоспармен қайта құруға болады.

Ген инженериясында генді мынадай әдістермен алуға болады:

Клеткадағы ДНҚ-дан тікелей кесіп алу – белгілі организмнің ДНҚ-сын түгелімен әр түрлі рестриктазалармен үзіп, әр түрлі ферменттер алады. Сонан соң оны клетка ішіне “арқалап” кіргізе алатын сақиналы плазмидалармен жалғайды. Ол үшін плазмиданы да рестриктазалармен үзеді, оған әлгі ДНҚ ферменттерін қосып жалғап, қайтадан бүтін плазмидалар алады. Бұл плазмидалардың әрқайсысының құрамында бір немесе бірнеше бөтен ДНҚ

гені болады. Одан кейін ло плазмидаларды қайтадан бактерияға енгізеді. Енді бактерия клеткасында басқа ағза генінің түрі бар.

Химиялық жолмен синтездеу – 1969 жылы Г.Корана ашқан. Бактериядағы басқа геннің промоторына жалғастырып, плазмида арқылы бактерия клеткасына енгізеді.

и-РНҚ-дан кері транскриптаза арқылы синтездеу – жүргізілген зерттеулер ДНҚ көшірмесінің пайда болуы үшін онкогендік вирустардың ғана РНК-сы емес, сондай-ақ жасанды полирибонуклеотидтердің де үлгі бола алатындығын көрсетті. Бұл кез келген жеке гендерді № олардың РНҚ-көшірмелерін қолдана отырып ферменттік синтездеуге болатынына мүмкіншілік туғызды.

4. Гендік инженерияда қолданылатын ферменттерді көрсетіңіз.

Гендік инженерияда, белгілі организмнің ДНҚ-сын тугелімен әр түрлі рестриктазалармен үзіп, әр түрлі фрагменттер алады. Содан кейін оны клетка ішінде «аркалап» кіргізе алатын сақиналы (дөңгелек) плазмидалармен жалғайды, Ол үшін плазмиданы да рестриктазалармен үзеді, оған әлгі ДНҚ фрагменттерін қосып жалғап, қайтадан бүтін плазмидалар алады. Бұл плазмидалардың әрқайсысының құрамында бір немесе бірнеше бөтен ДНҚ фрагменті (гені) болады, Одан кейін ол плазмидаларды қайтадан бактерияға еңгізеді. Осының нәтижесінде бактерия клеткасының әрқайсысында басқа организм генінің, бір түрі болады, Рестрикциялаушы эндонуклеазаларға сипаттама беріңіз. генді ферменттік синтезге сүйене отырып, кері транскрипция механизмнің көмегімен алуға да болады. Бұл механизм РНҚ-ға тәуелді ДНҚ-полимеразаның немесе кері транскриптазаның (ревертазалар) белсенділігіне байланысты. Бұл фермент ең алғаш он-когендік (залалды ісік) вирустарды зерттегенде табылған. Фермент әртүрлі РНҚ-ларда, синтетикалық полинуклеотидтерді қоса, ДНҚ-ның көшірмесін құра алатын қабілеті бар. Ревертазаның көмегімен, сәйкес иРНҚ-ның қатысуымен, іс жүзінде кез келген бөліп алуы жақсы игерілген генді алуға болады. Бұл әдісті белгілі бір тканьдарда өте қарқынды транскрипцияланатын гендерге қолдану тиімді. Осындай әдістермен адамның, сүтқоректілер мен құстардың кодтаушы глобиндері, өгіздің көз хрусталигінің (көз жанары) белогы, жұмыртқа белогы, жібек фибрионы (талшығы) және тағы басқа гендер алынды да өркендетілді. Ферментті синтездеп, пробиркада РНҚ молекуласынан ДНҚ генінің комплементарлы тізбегін жазып алуды транскрипция дейді. Синтездеу үшін қолданылатын жүйе құрамында ДНҚ-ға кіретін төрт нуклеотид, магний ионы, кері транскриптаза ферменті және генмен кодталған көшірмесін алатын иРНҚ бар. иРНҚ-дан кері транскрипта-за, оған сәйкес ДНҚ тізбегін синтездеп, сол ферменттің көмегімен ДНҚ-ның екінші тізбегі синтезделеді. Осының нәтижесінде иРНҚ-да синтезделген ген құрылымына ұқсас ген пайда болады. Осы әдіспен көптеген елдің лабораториясында бірнеше гендер тобы алынды.

5. Рестрикциялаушы эндонуклеазалар

Ген инженериясының немесе рекомбинантты ДНҚ технологиясының қалыптасуы ерекше ферменттер класы — эндонуклеазалардың немесе рестриктазалардың ашылуымен және қолданылуымен байланысты. Рестрикция ферменттерін 1972 ж. В. Арбер бактерия клеткасында ашты. Барлық бактериялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бөлігін үзе алатын бір немесе бірнеше рестриктазаларды синтездейді. Рестрикция ферменттерінің клеткадағы қызметі — бактерияға енген бөтен ДНҚ молекуласынан қорғау, рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның бактериялық клеткада кебеюіне жол бермейді.

Рестрикция ферменттерін синтездейтін клетканың ДНҚ молекуласы эндонуклеазалардың әсерінен үзілмейді, өйткені бұл клеткалар модификациялау ферменттерін синтездейді, олардың әсерінен ДНҚ-ның құрылымы модификацияланады (өзгереді) — ДНҚ-ның репликациясы кезінде рестриктаза танитын бөліктерге метил тобын (СНз)- жалғайды.Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза үзе алмайды. Мұны бактериялардың өзіндік бір иммундьқ жүйесі деп санауға болады. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енгең кейбір бактериофагтардың нуклеин қышқылы метилденіп кетеді де, бактериялар осы фагтың әсерінен лизиске ұщырайды. Рестриктазалардың негізгі үш типі: I, II және , III белгілі. Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер қатарын дәл тани алады. Алайда, рестриктазалардың I типі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны әр қилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II және III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дәл үзе алады. Эндонуклеазалардың I және ІІI типтер құрылымы күрделі және екі модификациялық және АТФ-ға тәуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар. Рестрликтазалардың II типі екі жеке белоктардан құралған: рестрициялаушы эндонуклеаза жэне модификациялаушы метилаза. Аталған себептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II типі пайдаланылады.Екінші жағынан; рестриктазаның II типі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері бар ДНҚ препараттарын алуға және әр түрлі геномдардан алынған фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады.

6. ДНК-полимеразаға жалпы анықтама беріңіз.

Бактерияларда ДНҚ-полимераза I, II және III ферменттері ашылған. Оның ішіндегі негізгісі ДНҚ молекуласы тізбегінің элонгациясына жауапты ДНҚ-полимераза III болып табылады. ДНҚ-полимераза I ферменті қалып жүретін тізбектегі «брешті» толтырады, ал ДНҚ-полимераза II ферментінің қызметі әлі белгісіз. Бастаушы тізбектің синтезі кезінде ДНҚ-полимераза ферментінде қосарланған 3′-соңы болады, ол келесі жаңа тізбекті синтездеуге көмектеседі. Бірақ-та «қалып жүретін» тізбекті синтездейтін ДНҚ-полимераза ферментіне 3′-соңымен қосарланған (3-гидроксилді тобы) «затравка» керек. Бұл затравканы қысқа РНҚ молекуласы ретінде рибонуклеотидүшфосфаттан ДНҚ-примаза ферменті синтездейді. Бұл процесс кезінде әр қысқа бөліктер ДНҚ молекуласының жаңа синтезін бастайды. Сонан соң 5′-фосфатдезоксирибонуклеотид қалдықтарын 3′-гидроксилді соңдарымен байланыстыратын ДНҚ-полимераза ферменті іске қосылады да ДНҚ тізбегінің қалыпты синтезі басталады. Келесі ретте синтезді бастаған «затравка» бөлініп кетеді де, бос кеңістік ДНҚ-мен толады. Сонымен Оказаки фрагменттері синтезінде «затравка» рөлін қысқа РНҚ молекулалары атқарады.

ДНҚ—полимеразалар (әсіресе бактериялардың ДНҚ-полимераза ІІІ-) нуклеотидтердің аналық тізбекке комплиментарлы синтезделуін қамтамасыз етуімен бірге 31—>5'-экзонуклеазалық-та қызмет атқарады. Соңғы қызметі ДНҚ синтезі барысында дұрыс —комплиментарлы нуклеотидтердің орнына, бұрыс, комплиментарлы емес нуклеотид, жалғанған кезде жүзеге асады. Осы кезде ДНҚ-полимераза бұрыс жұптасқан нуклеотидті «байқап» қалып, оны өсіп келе жатқан 31 ұшынан шығарып (үзіп) алып тастайды. Осылайша полимеразалар өз жүмыстарын үнемі бақылап отырады в) Кез келген жаңадан еинтезделген ДНҚ фрагменттері-(ұзын лидерлік не Оказаки фрагменттері) праймерлерден («РНҚ-ұйытқыдан) басталады. Аналық (матрицалық) тізбек бойымен жылжып отыратын ферменттік кешен келесі ДНҚ фрагментіне жанасқаннан кейін, ДНҚ-полимераза ІІІ ферменті «қыстырушы» РСNА ақуызын ашып, кешенді матрицадан ажыратады және ДНҚ синтезін тоқтатады. 5-сурет синтезделген ДНҚ фрагменттерінің түйісуі (Мушкамбаров, Кузнецовтан, 2003) Осыдан кейін ДНҚ полимераза І-іске кіріседі. Ол өсіп келе жатқан ДНҚ фрагментінің 3' ұшына жалғанады және 3 белсенділікке ие болады. Біріншіден ол «алдыңғы» немесе 51—>3'-экзонуклеазалық белсенділікке ие болады, яғни ол бұрынғы ДНҚ тізбегінің «РНҚ-ұйытқысының» (праймер) 51 ұшынан бір-бірлеп нуклеотидтерді алып тастап отырады, ал босаған жерге өз фрагментінің 31 ұшына дезоксинуклеотидтерді жалғайды (ДНҚ-полимеразалық белсенділік). Сонымен қатар, ДНҚ-полимераза ІІІ-сияқты «артқы» 31—>5' экзонуклеазалық белсенділік арқылы өз жұмысын қадағалауды да «ұмытпайды». ДНҚ-полимераза-І-қызметі өсіп келе жатқан ДНҚ фрагментінің бұрынғы ДНҚ фрагменттерінің дезоксинуклеотидтерімен түйіскеннен кейін аяқталады. Эукариоттарда ДНҚ-полимераза ІІІ-қызметін α және σ—ДНҚ полимераза кешені атқарады; бұл жерде 31—5' экзонуклеазалық белсенділік σ -ДНҚ —полимеразаға тиесілі болса, ДНҚ-полимераза І-қызметін, 51—>3' —экзонуклеазалық қызметті ерекше фермент нуклеаза (Н), ДНҚ-полимеразалық белсенділікті (босаған жерді толтыру) β -ДНҚ - полимераза атқарады. Жоғарыда аталған ферменттер кешені қызметтері нәтижееінде жаңадан синтезделінген әрбір тізбектер бір-бірімен тығыз орналасқан көптеген фрагменттерден тұрады.

7. Кері транскриптазаға анықтама беріңіз.

8. Гендік инженерияда қолданылатын ферменттерді көрсетіңіз.

Гендік инженерияда, белгілі организмнің ДНҚ-сын тугелімен әр түрлі рестриктазалармен үзіп, әр түрлі фрагменттер алады. Содан кейін оны клетка ішінде «аркалап» кіргізе алатын сақиналы (дөңгелек) плазмидалармен жалғайды, Ол үшін плазмиданы да рестриктазалармен үзеді, оған әлгі ДНҚ фрагменттерін қосып жалғап, қайтадан бүтін плазмидалар алады. Бұл плазмидалардың әрқайсысының құрамында бір немесе бірнеше бөтен ДНҚ фрагменті (гені) болады, Одан кейін ол плазмидаларды қайтадан бактерияға еңгізеді. Осының нәтижесінде бактерия клеткасының әрқайсысында басқа организм генінің, бір түрі болады, Рестрикциялаушы эндонуклеазаларға сипаттама беріңіз. генді ферменттік синтезге сүйене отырып, кері транскрипция механизмнің көмегімен алуға да болады. Бұл механизм РНҚ-ға тәуелді ДНҚ-полимеразаның немесе кері транскриптазаның (ревертазалар) белсенділігіне байланысты. Бұл фермент ең алғаш он-когендік (залалды ісік) вирустарды зерттегенде табылған. Фермент әртүрлі РНҚ-ларда, синтетикалық полинуклеотидтерді қоса, ДНҚ-ның көшірмесін құра алатын қабілеті бар. Ревертазаның көмегімен, сәйкес иРНҚ-ның қатысуымен, іс жүзінде кез келген бөліп алуы жақсы игерілген генді алуға болады. Бұл әдісті белгілі бір тканьдарда өте қарқынды транскрипцияланатын гендерге қолдану тиімді. Осындай әдістермен адамның, сүтқоректілер мен құстардың кодтаушы глобиндері, өгіздің көз хрусталигінің (көз жанары) белогы, жұмыртқа белогы, жібек фибрионы (талшығы) және тағы басқа гендер алынды да өркендетілді. Ферментті синтездеп, пробиркада РНҚ молекуласынан ДНҚ генінің комплементарлы тізбегін жазып алуды транскрипция дейді. Синтездеу үшін қолданылатын жүйе құрамында ДНҚ-ға кіретін төрт нуклеотид, магний ионы, кері транскриптаза ферменті және генмен кодталған көшірмесін алатын иРНҚ бар. иРНҚ-дан кері транскрипта-за, оған сәйкес ДНҚ тізбегін синтездеп, сол ферменттің көмегімен ДНҚ-ның екінші тізбегі синтезделеді. Осының нәтижесінде иРНҚ-да синтезделген ген құрылымына ұқсас ген пайда болады. Осы әдіспен көптеген елдің лабораториясында бірнеше гендер тобы алынды.

9. Рекомбинантты ДНҚ құрастыру әдістемелерін көрсетіңіз.

10. Молекулалық векторларға анықтама беріңіз.

11. Бактериялық плазмидаларға жалпы түсініктеме беріңіз.

Плазмидалар –ек тізбекті ДНҚ молкулалары ,мөлшері 10 3-10 6 н.п. олар бактерияларға аса қажетті қызметтерді кодтамайды, бактериялар қолайсыз жағдайларға ұшарағанда мағызды рөл атқарады. Фенотиптік өзгерістердің ішіде бактерия жасушаларына плазмидалар арқылы жеткізілетін көріністердің ішінде келесілерін атап кетуге болады: Антибиотиктерге тұрақтылық; Колицин түзу; Патогендік факторының өнімі; Антибиотиктік заттардың синтезделуіне қабілеттілік ; Күрделі органикалық заттарды ыдырату ; Рестрикция мен модификациялық ферменттерді түзу. Плазмидалық ДНҚ репликациясы батерия хромосомасының репликациясына қатысатын ферменттер жиынтығымен жүзеге асырылады, бірақ плазмидалардың репликациясы хромосомаға тәуелді емес . Кейбір плазмидалар қатаң бақылауда болады.бұл олардың репликациясының хромосомамен тығыз байланысын көрсетеді. Кейбір плазмидалар бактерия хромосомасына қайтымды тіркесіп, бір реклипон түрінде жүруі мүмкін. Олар интегративті плазмидалар немесе эписомалар деп аталады. Кейбір плазмидалар бір жасушадан келесі жасушаға , кейде бөгде токсономиялық бірлікке жататын жасушаларға да ауысып жүруі сүскін .Ондай плпзмидалар трансмиссивті деп аталады . трансмиссивтілік тек ірі плазмидаларға ғана тән олпрда tra – оперондар бар, оларда плазмидаларды тасымалдаушы гендер біріккен.ол гендер жыныстық кірпікшелерді кодтайды,яғни трансфиссивті плазмидасы жоқ жасушамен арасында жыныстық көпірше түзу арқылы плазмидалық ДНҚ келесі жаңа жасушаға беріледі. Бұл процесс коньюгация деп аталады. медициналық микробиологияда маңызды орынды антибиотиктерге тұраұтылық беретін плазмидалар, оларды R- плазмидалар деп тайды және ратогендік факторларының өнімдерімен қамтамасыдандырылатын , макроорганизмде инфекциялық процестің дамуына жағдай жасайтын плазмидалар .

R – плпзмидалар бактерияларға қарсы әсер ететін препараттарды бұзатын фериенттердің синтезін детерменттейтін гендері бар . Мұнда плазмидасы бар бактерия жасушасы дәрілік заттардың толық бір тобына , кейде кейбір препараттарға тұрақты болады. R – плпзмидалардың көбісі трансмиссивті болады, бактерия поппуляциясында тарала отырып , олады бактерияға қарсы препараттарға әсерсіз етеді. R – плпзмидалары бар бактерия штамдары ауруханаішілік инфекциялардың этиологиялық агенттері болып саналады.

Патогенділік факторларының синтезңн детерменттейтін плазмидалар қазіргі кезде адамдардың жұқпалы ауруларының қоздырғыштары болып табылытын көптеген бактерияларда табылып отыр . Шигеллездедің, иерсиниоздардың , оба күйдіргі иксодтық бореллиощдардың ішектік эшерехиоздардың қоздырғыштарының патогенділігі оларда патогнедік плазмидалардың болуымен байланысты. Бұл топтың плазмидаларының біріншілері Ent – плпзмида , ол энтеретоксиннің синтезделуін анықтайды , және Hly – плазмида E.coli – гемолизінің синтезін детерметтейді.

Кейбір бактериялардың жасушаларында басқа бактерияларға бактериоцитті заттардың синтезін детерменттейтін плазмидалары болады. Мысалы E.coli – колициннің синтезін анықтайтын Col – плазмида бар, оның колиформды бактерияларға бактериоцитті әсері бар .

12. Плазмидалық векторларға қойылатын шарттарды көрстеіңіз.

Плазмидалық векторлар - мөлшері 15— 20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмидалар бактериялардың хромосомадан тыс генетикалық элементі екендігін және олардың сипаттамасын біз қарастырған болатынбыз. Плазмидалық векторлар генді бактерияларға тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады.

Генетикалықинженерияда Е. Соlі бактериясы үшін көптеген векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1 плазмидасының туындылары кең таралды. Ф. Болвар және Р. Родригес құрастырған осындай плазмида — рВR322 бірнеше мың жұп негіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бүл плазмидада антибиотиктер — ампициллин мен тетрациклинге төзімділіктің гендері бар және бірнеше рестриктазалар үзе алатын сайттары (нуклеотидтік нүктелері) бар рВR322 плазмиданың құрамында екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және Тn З транспозоны бар. Ампициллинге тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына арналған сайтқа және тетрациклинге тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған қос сайтқа мән беріңіз. Осындай рестрикциялық сайттарда екі антибиотиктерге төзімділік гендерінің болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға мүмкіндік береді.

Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен үзеді де, босаған орынға бөтен ДНҚ молекуласын (олар да, алдын ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі) жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты плазмида тетрациклинді ортада өсе алмайды, өйткені плазмиданың tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді ортада өсе алады, міне, осындай ортада көбейетін бактериялардан қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.

pBR322 векторынан басқа СоlЕ1 плазмидасы негізінде бірнеше векторлар құрастырылған.Басқа плазмидалар (рSC101 т. б.) негізінде алынған векторлар да белгілі.

СolЕ1 плазмидасы негізінде құрастырылған вектордың кемшілігі де бар: бөтен ДНҚ-ның молекулалық массасы артқан сайын рекомбинанттардың саны (копиялары) азая түседі. Осы себептен ұзын ДНҚ фрагменттерінің (10 мың. н.ж. асатын) клондарын алу үшін фагтық векторларды, космид және фазмидтерді пайдаланады.

13. рBR322 плазмидалық векторына сипаттама беріңіз.

Генетикалықинженерияда Е. Соlі бактериясы үшін көптеген векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1 плазмидасының туындылары кең таралды. Ф. Болвар және Р. Родригес құрастырған осындай плазмида — рВR322 бірнеше мың жұп негіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бүл плазмидада антибиотиктер — ампициллин мен тетрациклинге төзімділіктің гендері бар және бірнеше рестриктазалар үзе алатын сайттары (нуклеотидтік нүктелері) бар рВR322 плазмиданың құрамында екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және Тn З транспозоны бар. Ампициллинге тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына арналған сайтқа және тетрациклинге тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған қос сайтқа мән беріңіз. Осындай рестрикциялық сайттарда екі антибиотиктерге төзімділік гендерінің болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға мүмкіндік береді.

Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен үзеді де, босаған орынға бөтен ДНҚ молекуласын (олар да, алдын ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі) жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты плазмида тетрациклинді ортада өсе алмайды, өйткені плазмиданың tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді ортада өсе алады, міне, осындай ортада көбейетін бактериялардан қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.

pBR322 векторынан басқа СоlЕ1 плазмидасы негізінде бірнеше векторлар құрастырылған.Басқа плазмидалар (рSC101 т. б.) негізінде алынған векторлар да белгілі.

14. Бактериофаг геномы негізіндегі векторларды көрсетіңіз.

Вектор ретінде бактериялармен қатар вирустар да қолданылады. Олардан вектор алу әдістемесі лямбда (λ) фагында жете зерттелген. Лямбда фагтың ДНҚ-сы қос тізбекті және формасы түзу, оның геномы 48,5 мың н. ж. тұрады. Фаг ДНҚ-сының 12 н.ж. құралған комплементарлы жабысқақ ұштары бар. Олар, фаг клеткаға енгеннен кейін бір-бірімен бірігіп, ДНҚ сақиналы формаға ауысады. Сақиналы ДНҚ репликациялық форма болып саналады. Лямбда фагтың ДНҚ

молекуласында 60-тай ген бар. Фагтың геномында лизистік даму мен ұрпағын көбейту үшін қажет гендері (маңызды) жоқ екі учаскесі бар. Бірінші учаске фаг геномының орталық бөлігінде (маңызды емес гендер) орналасқан, оның ұзындығы 22,0 мың н.ж. тең, екінші учаске P менQ гендері арасында орналасқан, ұзындығы 3,0 мың н. ж. тең.Міне, осы бөліктерді бөтен ДНҚ молекуласымен ауыстыруға болады. Лямбда фагтың вектор ретінде кең таралуы осы қасиеті мен ерекшелігіне байланысты, бұдан басқа оның орташа фаг екендігі бұрыннан белгілі.

Сонымен фагтың басына 25.0 мың н. ж. құралған бөтен ДНҚ-ны енгізуге болады. Фагтың қалыпты геномы 48,5 мың н.ж. құралғанымен, оның басына 38,0 мын, н.ж. кем емес және 53,0 мың н. ж. артық емес ДНҚ жинала алады, фагтың белокты капсиды ДНҚ-ның осындай мөлшерлерін қоршай алады. Лизистік дамуға қажет ген 29,0 мың н.ж. тең болғанымен, вектордың қалыпты тіршілік етуіне қажет фаг геномының мөлшері 38,0 мың н.ж. кем болмауы керек. Ғалымдар қазіргі кезде лямбда фагтың негізінде аталған шектеулер мен фаг қасиеттерін ескеріп, түрлі рестриктазалардың көмегі бірқатар векторлық молекулалар құрастырды: харон — λфаг, λgt — фаг, ЕМВ1З, λFIХ, λZАР және т. б.

Кейінгі уақытта жалғыз тізбекті ДНҚ -сы бар фаг — М1З негізінде де жақсы векторлар алынды. Жетілген М1З фагының жалғыз ДНҚ молекуласының ұзындығы 6,5 мың н.ж. тең. Клеткаға енгеннен кейін қос тізбекті репликациялық формаға айналып, өзінің 100—200 көшірмесін синтездейді. Ары қарай асимметриялы синтез жүреді: жетілген фагтың құрамына кіретін жалғыз тізбекті ДНҚ ғана синтезделеді. М1З фагы клетканы лизиске душар еткізбейді, бірақ оның бөлінуін бәсеңдетеді. Осының нәтижесінде жетілген фагтар клеткадан ортаға үздіксіз бөлініп тұрады. М1З фагының вектор ретінде негізгі артықшылығы жалғыз тізбекті векторлық ДНҚ-ны ыңғайлы жеке күйде тасымалдай алу қабілетіне байланысты. Мұндай ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарының Сэнгер әдісімен тез анықталуы генетикалық эксперименттерді жеңілдетеді. Тағы да, қазір пайдаланылатын барлық векторларға қарағанда, оларды бөлу және көшірмелерін алу оңайға соғады.

15. Космидті векторлардың конструкцисына сипаттама беріңіз.

Ген инженериясында қолданылатын векторларды үш топқа бөлуге болады: 1) плазмидалар; 2) бактериофагтар; 3) космидтер және фазмидтер. Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ технологиясында алғашқы екі векторлар типі жиі пайдаланылады, егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда ген клеткаға трансформация типімен енеді, ал бактериофаг (фаг лямбда) қолданылса, онда ген клеткаға трансдукция типімен енеді.

Космид — лямбда фагтың соs — учаскесі (жабысқақ ұштар) бар плазмида яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридтік молекуласы. Оларды алғаш рет 1978 ж.. Дж. Коллинз бен Б. Хон ашты. Космидтік плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликациялануына мүмкіндік береді, ал лямбда фагтың геномына жататын бөлігі -— соs тізбек — космидтің фаг капсидінің ішіне in vitro жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кәдімгі инфекция арқылы ене алады. Мұның өзі трансформация процесінің тиімділігін ең аз дегенде 100 есе арттырады.

Космидтік векторларда мөлшері 33—49 мың н.ж. бөтен ДНҚ фрагменттерін көбейтуге болады. Космидтер сыйымдылығы ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық ДНҚ-ның үлкен фрагменттерінің көшірмелерін және геномның гендер банкісін (жинағыш) клондардың ба-рынша аз санымен алу үшін арнайы құрастырылған.

16. Экспрессиялаушы векторларға анықтама беріңіз.

17. Белоктардың секрециялануын қамтамасыз етеін векторларды көрсетіңіз.

18. Бинарлы векторларға жалпы анықтама беріңіз.

Фаг ретінде де, плазмида ретінде де дамуға қабілетті фаг пен плазмиданың арасындағы гибридтер фазмида немесе бинарлы векторлар деп аталады. Мұндай векторда СоlЕ1 мен λ фагтың инициация нүктесі бар және олар бактериофаг сияқты лизистік, плазмидалар сияқты лизистік емес дамуғақабілетті.

Фазмидалық векторлардың сыйымдылығын лямбда фаг негізіндегі векторлармен салыстыруға болады, ол космидтерден анағұрлым аз.

Сонымен жоғарыда баяндалған мәліметтерден ген инженериясының векторлар системасы микроорганизмдердің және олардың генетикалық элементтерінің қасиеттеріне негізделгенін байқауға болады. Векторлық молекулаларға қойылатын негізгі талаптардың бірі, оларда рестрикциялық нүктелер болуы керек екендігін де атап өттік. Кейбір векторларда рестрикциялық бөліктер артық болуы мүмкін. Мұндай жағдайда, ондай бөліктерді векторлардан делеция (бір немесе бірнеше нуклеотидтерді ДНҚ-дан иондық сәулелер және т. б. әсерімен үзілуі) көмегімен «алып» тастайды.

Керісінше, вектордың керекті бөлігіңде эксперимент үшін аса қажет және рестриктаза үзе алатын тізбектер жоқ болуы да мүмкін. Бұл үшін химиялық синтездеу арқылы рестриктаза тани алатын нуклеотидтер тізбегі бар қысқа синтетикалық олигонуклеотид алынады. Лигазаның көмегімен қысқа синтетикалық олигонуклеотид вектордың керекті бөлігіне жалғанады. Оларды линкер — жалғаулық (ағыл. біріктіру сөзінен) деп атайды. Линкерде әр түрлі бірнеше рестриктазалар үшін тізбектер бар болса, оларды полилинкер деп атайды.

19. Маркерлік гендер: селективті маркерлік гендер және репортерлік гендерге анықтама беріңіз.

20. Өсімдік гендік инженериясына жалпы сипаттама беріңіз және өсімдік клеткаларын трансформациялау әдісін көрсетіңіз.