I/\huiTinri 1ГГЖ1Ж ттлагтлтта» ж I DT>1 l\ тж

следуемой инактивированной сывороткой крови или плаз­мой. В лунку на пластине из плексигласа (или на обычное стекло) наносят 3 капли сыворотки и добавляют 1 каплю кардиолипинового антигена. Смесь тщательно перемешивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризу­ется образованием и выпадением хлопьев разной величины; при отрицательном результате наблюдается равномерная лег­кая опалесценция. Положительная реакция микропреципита­ции позволяет поставить предварительный диагноз и направить пациента на дальнейшее обследование.

Реакцию Вассермана ставят одновременно с двумя антигенами: 1) специфическим, содержащим антиген возбуди­теля — разрушенные ультразвуком трепонемы; 2) неспецифи­ческим — кардиолипиновым. Исследуемую сыворотку разводят в соотношении 1:5 и ставят РСК по общепринятой методике. При положительной реакции наблюдается задержка гемоли­за, при отрицательной — происходит гемолиз эритроцитов, интенсивность реакции оценивается соответственно от (++++) До (-)•

Первый период сифилиса является серонегативным и харак­теризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50 % боль­ных реакция становится положительной не ранее чем через 2—3 нед после появления твердого шанкра. Во II и III периоде сифилиса частота положительных реакций достигает 75—90 %. После успешно проведенного курса лечения реакция Вассер­мана становится отрицательной.

Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса мож­но ставить реакцию Вассермана, используя спинномозговую жидкость, с теми же антигенами, что и в реакции с сывороткой больного.

РИФ —реакция непрямой ИФ—является специфи­ческой при диагностике сифилиса. В качестве антигена ис­пользуют взвесь тканевых трепонем. Разработаны разные ме­тодики постановки реакции; обычно используют модифика­цию РИФ-200. Сыворотку больного инактивируют так же, как для реакции Вассермана, и разводят в соотношении 1:200. На предметные стекла наносят каплю антигена, высушивают и фиксируют 5 мин в ацетоне. Затем на препарат наносят сыво­ротку больного, через 30 мин промывают и высушивают. Сле­дующим этапом является обработка препарата флюоресцирую­щей сывороткой против иммуноглобулинов человека. Изучают препарат с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.

Реакция иммобилизации трепонем также являет­ся специфической. Принцип реакции заключается в угнетении движения трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови пациента в присутствии комплемента. Живую культуру

трепонем получают при культивировании в яичке кролика. Яичко зараженного животного измельчают в специальной сре­де, в которой трепонемы сохраняют подвижность. Ставят ре­акцию следующим образом: взвесь тканевых (подвижных) тре­понем смешивают в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контрольную пробирку вместо исследуемой сыворотки добавляют сыворотку здорового человека, в другую — вместо свежего комплемента добавляют инактивированный. После инкубации при 35 "С в анаэробных условиях (анаэростат) из всех пробирок готовят препарат "раз­давленная" капля и в темном поле определяют количество подвижных и неподвижных трепонем. Процент специфически иммобилизированных трепонем определяют по формуле:

т_х-т₀

Х= ^х_т °х100,

где Т_к — число подвижных трепонем в контроле (с инактиви-рованным комплементом), Т₀ — число подвижных трепонем в опыте (с активным комплементом). Результат реакции считают положительным, если процент иммобилизации выше 50, сла­боположительным — от 31 до 50, сомнительным — от 21 до 30 и отрицательным — ниже 20. Для обнаружения специфических антител к T.pallidum используют и другие серологические ре­акции, в частности РНГА.

Необходимо отметить, что в широкой медицинской прак­тике при обследовании больных и здоровых лиц обычно ис­пользуют реакцию Вассермана и микропреципитации; РИТ, РИФ и другие специфические реакции применяют для уточ­нения диагноза и проводят в специализированных лаборато­риях.

• Микробиологическая диагностика мягкого шанкра

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое из язвы (мягкого шанкра).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование.Проводят путем микро­скопии мазков, окрашенных по методу Грама и метиленовым синим. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий, распо­лагающихся в виде длинных цепочек, позволяет подозревать наличие возбудителя — Н. ducreyi.

Бактериологическое исследование.Проводят путем выделе­ния чистой культуры возбудителя. Материал засевают на кро­вяной агар или другие среды, содержащие дефибринированную кровь. На этих средах H.ducreyi через 48—72 ч образует мелкие круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. Идентифика­цию выделенной культуры проводят по ферментации Сахаров

и по способности агглютинироваться сывороткой этого же больного.

Кожно- аллергическая проба. Ставят с антигеном из Н.ducreyi для подтверждения диагноза.

• Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты

Антигены для реакции Вассермана:

1) специфический антиген из тканевых трепонем, разру­шенных ультразвуком;

2) неспецифический кардиолипиновый антиген — высоко-очищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липидов, смешанных в определенной про­порции с лецитином и холестерином.

Антигены разводят согласно инструкции и используют в рабочих-дозах, указанных на этикетках. Кардиолипиновый ан­тиген используют также и в реакции микропреципитации.

Антибиотики: пенициллин, цефотаксим, тетрациклины, эритромицин.

Тема 15.2. ВОЗБУДИТЕЛИ ГОНОРЕИ, УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА, МИКОПЛАЗМОЗА И УРЕАПЛАЗМОЗА

А План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей гонореи, уроге-нитального хламидиоза и уреаплазмоза; их патоген-ность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

2. Лабораторная диагностика.

3. Диагностические и лечебные препараты.

а Демонстрация

Neisseria gonorrhoeae — в мазках из чистой культуры и уретрального гноя, окраска по методу Грама.

2. Chlamydia trachomatis — в мазках со слизистой оболоч­ки мочеиспускательного канала (иммунофлюоресцент-ный метод или окраска по методу Романовского— Гимзы).

3. "Пестрый" ряд для определения биохимических свойств N. gonorrhoeae.

4. Колонии Mycoplasma hominis на питательной среде (или фотографии этих колоний).

5. ИФА для серодиагностики урогенитальных инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами.

6. Диагностические и лечебные препараты.

А Задание студентам

1. Указать материал для исследования.

2. Микроскопировать и зарисовать мазок из уретрально­го гноя, окрашенный по методу Грама, сделать заклю­чение.

3. Зарисовать демонстрируемый мазок со слизистой обо­лочки мочеиспускательного канала. Сделать заключе­ние.

4. Оценить результаты ИФА при урогенитальных инфек­циях, вызванных хламидиями и микоплазмами. Сде­лать заключение.

5. Дать краткую характеристику демонстрируемым диа­гностическим и лечебным препаратам.

А Методические указания

• Микробиологическая диагностика гонореи

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гнойное отделяемое, мазки со слизистых оболочек мочеполовых органов и прямой кишки, суставной и перитонеальный экссудат, отделяемое конъюнктивы глаза при бленнорее.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Материал для исследова­ния должен быть максимально быстро доставлен в лаборато­рию во избежание аутолиза гонококков, которые очень чувст­вительны к изменению температуры и охлаждению. Из мате­риала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама, а также метиленовым синим (схема 15.2.1). При положительном ре­зультате в мазках обнаруживают грамотрицательные диплокок­ки бобовидной формы, находящиеся внутри лейкоцитов (рис. 15.2.1; на вклейке). Положительный бактериоскопический диа­гноз ставится в основном при острой форме гонореи до при­менения антибиотиков. При хронической гонорее бактерио­скопическое исследование часто дает отрицательный результат, так как в этих случаях возбудители могут иметь атипичную форму в виде шаров или, наоборот, очень мелких образований. Кроме того, в препарате обнаруживают разнообразную посто­роннюю микрофлору, лейкоциты, эпителиальные и другие кле­точные элементы.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на чашки Петри со специальными питательными средами — КДС, сывороточным агаром и др. Среда КДС содержит питательный агар с добавлением казеина, дрожжевого экстракта и сыворот­ки крови. Посевы инкубируют при 37 "С в атмосфере с повы­шенным содержанием С0₂ (не менее 3 %) в течение 24—72 ч. Гонококки образуют круглые прозрачные колонии, напоми­нающие капли росы в отличие от более мутных колоний стреп-

тококков или пигментированных колоний стафилококков, ко­торые также могут расти на этих средах. Подозрительные ко­лонии пересевают в пробирки на соответствующие среды для получения чистых культур, которые идентифицируют по саха-ролитическим свойствам на средах "пестрого" ряда (полужид­кий агар с сывороткой и углеводом) или с помощью микро­тест-систем. Гонококки ферментируют только глюкозу с обра­зованием кислоты.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.Иммуно­химические исследования. Антигены возбудителя могут быть обнаружены в исследуемом материале с помощью чувствительных иммунологических методов (иммуноблотинг и

ДР-)-

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз. ДНК возбуди­теля в материале может быть обнаружена также методом гиб­ридизации со специфическим ДНК-зондом.

• Микробиологическая диагностика урогенитального хлами-диоза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки мочеиспускательного канала, выделения из шейки матки, соскобы, отпечатки и др.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологическое исследование.Препараты, содержащие клет­ки, окрашивают по методу Романовского—Гимзы. В положи­тельном случае в клетках эпителия обнаруживают цитоплазма-тические включения — микроколонии возбудителя, которые могут содержать как ретикулярные (сетчатые) тельца, так и элементарные тельца. Внеклеточные элементарные тельца таким способом не выявляются. Микроскопия окрашенных препаратов имеет ориентировочное значение.

Бактериологическое исследование.Чистую культуру хлами-дий из исследуемого материала выделяют путем заражения культур клеток McCoy, HeLa и других линий. После инкубации в течение 48 ч определяют включения возбудителя в клетках иммунофлюоресцентным методом. Выделение хламидий в культуре клеток имеет важное диагностическое значение, по­зволяет выявить жизнеспособные хламидий и определить их чувствительность к антимикробным препаратам.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.Иммуно­химические исследования. Метод ИФ позволяет обна-

Глава 16

ружить антигены хламидий в зараженных клетках. Препараты из исследуемого материала обрабатывают мечеными МКАТ. В люминесцентном микроскопе хорошо видны ярко-зеленые скопления элементарных и ретикулярных телец (внутриклеточ­ные микроколонии), контрастно выделяющиеся на краснова­то-коричневом фоне эпителиальных клеток.

Антигены возбудителя в исследуемом материале могут быть выявлены с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА и др.).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Основана на определении антител к хла-мидиям в сыворотке крови методами ИФА, РСК, РИГА. В ка­честве антигенов используют родоспецифические антигены (ЛПС), полученные из хламидий, диагностический титр 1:64. ИФА применяют так же, как дополнительный серологический метод при дифференциальной диагностике урогенитальных ин­фекций, вызванных хламидиями и микоплазмами.