Микробиологическая диагностика иерсиниоза.
Леч., пед. ф-ты 2006
ЗАНЯТИЕ 17
Тема: Микробиологическая диагностика бактериальной дизентерии.
Микробиологическая диагностика иерсиниоза.
Цель: На основе знаний биологии шигелл, иерсиний и особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию вызываемых ими заболеваний.
Знать:
1. Особенности биологии шигелл и иерсиний, определяющие их роль в инфекционной патологии человека.
2. Экологию шигелл и иерсиний, особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета, вызываемых ими заболеваний.
3. Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых шигеллами и иерсиниями.
4. Неспецифическую профилактику заболеваний, вызываемых шигеллами и иерсиниями.
5. Специфическую терапию заболеваний, вызываемых шигеллами.
Уметь:
1. Отобрать на средах первичного посева характерные для шигелл и иерсиний лактозонегативные колонии.
2. Изучить морфо-тинкториальные свойства и проверить чистоту выделенных копрокультур.
3. Учесть и оценить результаты изучения биохимических (среда Клиглера, «пестрый ряд») и антигенных свойств копрокультур с целью их идентификации.
4. Учесть и оценить результаты РПГА с сывороткой обследуемого с подозрением на хроническую дизентерию.
5. Заполнить бланки-направления и бланки-ответы из бак. лаборатории.
Контрольные вопросы:
1. Классификация и морфобиологические свойства шигелл и иерсиний.
2. Факторы вирулентности шигелл и иерсиний.
3. Особенности экологии, эпидемиологии и патогенеза заболеваний, вызываемых шигеллами и иерсиниями.
4. Материалы и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых шигеллами и иерсиниями.
5. Специфическая терапия бактериальной дизентерии.
6. Неспецифическая профилактика заболеваний, вызываемых шигеллами и иерсиниями.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИPC):
1. Провести бактериологическое исследование испражнений обследуемого с подозрением на бактериальную дизентерию:
1.1. Изучить результаты посева испражнений обследуемого на среде Эндо и Плоскирева, отобрать характерные для шигелл лактозонегативные колонии.
1.2. Изучить копрокультуру, выделенную от обследуемого, на среде Клиглера (демонстрация) и МПА, для чего:
- учесть биохимическую активность на среде Клиглера;
- приготовить фиксированный препарат из культуры на МПА, окрасить по Граму, промикроскопировать;
- поставить РА на стекле с сывороткой FNS и оценить полученные результаты.
1.3. Учесть и оценить результаты «пестрого ряда».
1.4. Учесть и оценить результаты РА с соответствующими поливалентными, типовыми, групповыми и видовыми сыворотками.
1.5. Учесть и оценить результаты определения антибиотикограммы диско-диффузионным методом.
1.6. Полученные результаты занести в протокол и сделать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
2. Учесть и оценить результаты РПГА с сывороткой крови обследуемого с подозрением на хроническую форму дизентерии и эритроцитарными диагностикумами Флекснера и Зонне. Полученные результаты занести в протокол и сделать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
3. Провести бактериологическое исследование испражнений обследуемого с подозрением на иерсиниозную инфекцию:
3.1. Изучить результаты посева испражнений обследуемого на среде Эндо и Плоскирева, отобрать характерные для иерсиний лактозонегативные колонии.
3.2. Изучить копрокультуру, выделенную от обследуемого, на среде Клиглера (демонстрация) и МПА, для чего:
- учесть биохимическую активность на среде Клиглера;
- приготовить фиксированный препарат из культуры на МПА, окрасить по Граму, промикроскопировать.
3.3. Учесть и оценить результаты «пестрого ряда».
3.4. Учесть и оценить результаты РА с диагностическими иерсиниозными сыворотками.
3.5. Полученные результаты занести в протокол и сделать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
4. Охарактеризовать биопрепараты: диагностические агглютинирующие дизентерийные сыворотки: поливалентные, типовые, групповые, видовые; дизентерийный бактериофаг; спиртовая дизентерийная вакцина; эритроцитарные диагностикумы Флекснера и Зонне; дизентерин; агглютинирующие диагностические иерсиниозные сыворотки, указав, что они содержат, для чего и как применяются.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Проведите бактериологическое исследование испражнений обследуемого с подозрением на бактериальную дизентерию:
1 этап. Испражнения забирают сразу после дефекации из судна без следов дезинфектантов или с помощью ректальной петли. При наличии в испражнениях слизисто-гнойных комочков их необходимо включать в отбираемые пробы. Наиболее эффективным является посев испражнений «у постели больного», т.е. сразу после их получения, но не позднее 2 ч. Посев осуществляется петлей или шпателем на чашки со средами Плоскирева, Эндо (Левина) и магниевую среду накопления.
На 2 этапе изучите результаты посева испражнений на среды Плоскирева и Эндо (Левина) и отберите колонии, характеристика которых совпадает с характеристикой предлагаемого возбудителя.
На средах Плоскирева, Эндо (Левина) шигеллы образуют бесцветные (лактозонегативные), прозрачные колонии, с глянцевой поверхностью и ровным краем. Характерные колонии отвивают на среду Клиглера и МПА, термостатируют при 37°С 18-24 часа.
На 3 этапе изучите результаты роста копрокультуры на среде Клиглера (демонстрация). Из копрокультуры, растущей на МПА, приготовьте мазки, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Поставьте с копрокультурой, растущей на МПА, РА на стекле с поливалентной сывороткой FNS. Полученные результаты занесите в протокол и сделайте вывод.
Культуры, ферментирующие глюкозу до кислоты или кислоты и газа (изменение цвета столбика среды, соответственно цвету индикатора и появление пузырьков газа) и не ферментирующие лактозу (цвет косяка не изменяется), подвергают дальнейшему изучению, как подозрительные на шигеллы. Для чего из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. С чистыми культурами грамотрицательных бактерий, расщепляющих глюкозу и не расщепляющих лактозу, поставить РА на стекле с поливалентной сывороткой FNS.
Для окончательной идентификации выделенной культуры производят посев на «пестрый ряд»: среды Гисса с глюкозой, маннитом, лактозой, сахарозой и МПБ для определения индола и H2S. Определение антибиотикограммы проводят диско-диффузионным методом.
На 4 этапе учтите и оцените результаты «пестрого ряда» (демонстрация). Для изучения антигенной структуры учтите результаты РА с адсорбированными видовыми сыворотками, а затем с соответствующими типовыми и групповыми сыворотками (см. антигенную структуру шигелл) (демонстрация). Определите антибиотикограмму выделенной копрокультуры.
По результатам всех этапов исследований сформулируйте окончательный ответ, указав при этом вид возбудителя и его отношение к лекарственным препаратам; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
2. Проведите серологические исследования по обнаружению антител к предлагаемому возбудителю в сыворотке крови обследуемогоо с подозрением на хроническую форму дизентерии:
Учтите и оцените результаты РНГА с эритроцитарными диагностикумами Флекснера и Зонне (см. занятие № 10). Полученные результаты занесите в протокол и сделайте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
Постановка: В лунках пластмассовых пластин готовят два ряда последовательных разведений сыворотки обследуемого и вносят эритроцитарные диагностикумы Флекснера и Зонне. Параллельно ставят соответствующие контроли.
Оценка: сопоставляют титр РНГА с диагностическими титрами, которые составляют в РНГА с диагностикумом Флекснера 1/200 и с диагностикумом Зонне 1/100.
3. Проведите бактериологическое исследование испражнений обследуемого с подозрением на иерсиниозную инфекцию:
1 этап. При диагностике иерсиниозных инфекций параллельно с посевом на плотную питательную среду (Эндо) исследуемый материал засевают на среду накопления (фосфатно-буферную среду или др.).
Посевы на среде накопления культивируют при t° +4-5 до 30 дней, периодически высевая через каждые 3-5 дней на плотные среды. Иерсинии при низкой t° размножаются в отличие от остальных энтеробактерий. Наиболее часто культуры иерсиний выделяют после 7 суток.
На 2 этапеизучите результаты посева испражнений обследуемого на среде Эндо, дайте характеристику колоний и отберите те из них (не менее 3-х), характеристика которых совпадает с характеристикой колоний предполагаемого возбудителя.
На среде Эндо через 24 ч иерсинии видов Y. enteroсоlitica, Y. pseudotuberculosis вырастают в виде мелких (0,3-0,5 мм), выпуклых, гладких лактозонегативных колоний; к 40-48 ч они увеличиваются в размерах, приобретая розовый оттенок. Характерные колонии отсевают на дифференциально-диагнос-тическую среду Клиглера (Ресселя) и МПА.
На 3 этапе оцените биохимическую активность выделенных культур на среде Клиглера, приготовьте фиксированный препарат из тех же культур на МПА, окрасьте по Граму и промикроскопируйте.
Иерсинии при росте на среде Клиглера не изменяют цвет скошенной части, т. к. не ферментируют лактозу и изменяет цвет столбика, т. к. ферментируют глюкозу до кислоты без газа. Иерсинии – грамотрицательные, мелкие, овоидные, характеризующие полиморфизмом, палочки.
На 4 этапе учтите и оцените результаты «пестрого ряда» (демонстрация). Для идентификации и дифференциации Y. enteroсоlitica, Y. pseudotuberculosis используйте набор тестов, представленных в таблице:
| № пп | Тесты | Y. enteroсоlitica | Y. pseudotuberculоsis |
| 1. | Мочевина | + | + |
| 2. | Фенилаланин | - | - |
| 3. | Сахароза | + | - |
| 4. | Рамноза | - | + |
| 5. | Арабиноза | + | + |
| 6. | Маннит | + | + |
| 7. | Подвижность: 37° 22° | - + | - + |
Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к видам Y. enteroсоlitica и Y. pseudotuberculosis. Ее проводят в РА на стекле по общепринятой методике (см. занятие № 10) с диагностическими сыворотками к Y. enteroсоlitica наиболее распространенных сероваров (03, 05, 06, 08, 09) и к Y. pseudotuberculosis (поливалентные к сероварам I-V, а затем моновалентные).
На основании полученных результатов определите видовую принадлежность выделенной культуры, занесите результаты в протокол, заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
4. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты: агглютинирующие видовые, групповые, типовые, поливалентные сыворотки; дизентерийный бактериофаг; спиртовая дизентерийная вакцина; эритроцитарные диагностикумы Флекснера и Зонне; дизентерин; агглютинирующие диагностические иерсиниозные сыворотки. Укажите, что они содержат, для чего и как применяются.
Вопросы для самоконтроля:
1. Обоснуйте выбор сред для первичного посева испражнений с целью диагностики бактериальной дизентерии и иерсиниоза.
2. Назовите виды шигелл, имеющие наибольшее эпидемиологическое значение на современном этапе.
3. Обоснуйте путь передачи инфекций при иерсиниозах, исходя из экологии возбудителя.
4. Почему бактериальную дизентерию называют болезнью «грязных рук»; возможно ли назвать инфекции, вызываемые иерсиниями, болезнью «грязных рук». Обоснуйте.
5. Обоснуйте выбор методов микробиологической диагностики острой и хронической бактериальной дизентерии.
6. Назовите время выдачи положительного ответа из бак. лаборатории при подозрении на бактериальную дизентерию.
7. Какие свойства лежат в основе дифференциации и идентификации шигелл, иерсиний.
8. Меры неспецифической профилактики бактериальной дизентерии и иерсиниозов.
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 385-389, 401, 403-406.
2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 357-360, 365, 369-371.
Лекции по микробиологии.
Тесты.