Підготовчі роботи перед приготуванням зрізів біологічних об’єктів
Перед початком роботи скла добре миють, знежирюють і протирають серветкою. При цьому скло тримають за торці пальцями лівої руки, а серветку - правої. Особливої обережності вимагають покривні скла, оскільки вони дуже тонкі і крихкі.
Скло повинне мати постійне місце на предметному столику.
У центр предметного скла наносять краплю рідини (вона не повинна розтікатися). У неї вносять об'єкт і накривають покривним склом.
Покривне скло беруть за торці, прикладають нижнім ребром до краплі і притримуючи препарувальною голкою, дбайливо опускають. Не дозволяється класти покривне скло плоско і швидко, тому що в рідині з'являються пухирці повітря, які заважають мікроскопуванню. Не допускається натискати пальцем або серветкою на покривне скло. Повітря можна витиснути з-під скла легким натисненням ручкою препарувальної голки зверху на скло.
Рідина не повинна виступати за межі покривного скла і тим більше не попасти на нього. Надлишок рідини дбайливо прибирають смужкою фільтрувального паперу. При недостатності рідини наносять додатково краплю на предметне скло поруч з покривним і вона заповнить пустоти.
Якщо рідину під склом треба замінити, то з одного кінця покривного скла кладеться смужка фільтрувального паперу. Папір, який всмоктав рідину, знімають.
Всі маніпуляції з покривним склом і об'єктом проводять при допомозі препарувальної голки.
Приготування зрізів.
Зрізи бувають поперечні (ріжуться перпендикулярно осі органу), подовжньо-радіальні (вздовж органу по радіусу) і подовжньо-тангенціальні (вздовж органу, перпендикулярно радіусу).
Роблять зрізи лезом, його держать без напруження за один кінець великим і вказівним пальцями правої руки точно перпендикулярно до об'єкта.
Тверді і товсті об'єкти беруть великим і вказівним пальцями лівої руки так, щоб поверхня, яку зрізають, виступала на 5-10 мм над пальцями. М'які, тонкі або дрібні об'єкти затискають половинками серцевини бузини або ії кіркою, шматочками моркви або картоплі.
Поверхня, яку зрізають, перед цим вирівнюється. Щоб зробити тонкий зріз лезо ретельно притискують найближчим кінцем до гладкої поверхні і плавно протягають на себе. Отриманий зріз відразу переносять голкою на предметне скло в краплю рідини. Поверхню об'єкта знову підрівнюють і роблять не менше за 5-6 нових зрізів. Їх переглядають при малому збільшенні, не накриваючи склом, і невдалі (товсті, криво зрізані і розірвані) препарати відбраковують. Далі зрізи забарвлюють потрібними реактивами (дивись доповнення “мікрохімічні реакції”). Всі маніпуляції зі зрізами проводять швидко, але дбайливо, при цьому користуються препарувальними голками і пінцетом.
Мікроскопічні препарати. Біологічні об’єкти можна досліджувати як живими, так і фіксованими. В останньому випадку матеріал для більш детального вивчення можна розділити на частини і обробити різними барвниками для того, щоб виявити та ідентифікувати різні структури. З досліджуваного об’єкта можна виготовити тимчасові або постійні препарати.
Постійні препарати виготовляються в декілька етапів, після їх виготовлення вони можуть зберігатися багато років.
1. Фіксація – це збереження матеріалу в стані, близькому до природного. Для фіксації необхідно швидко видалити тканину. Це краще досягається при роботі з маленьким шматочком живого матеріалу. Фіксація здійснюється за допомогою спеціальних фіксуючих речовин (спирт, формалін, ацетон і ін.). Швидка фіксація дає можливість зберегти початкову структуру матеріалу.
2. Зневоднення здійснюється шляхом проведення препарату через низку водних розчинів етанолу у зростаючих концентраціях і закінчуючи абсолютним (чистим) спиртом. Для цього можна також використовувати пропанол, ацетон і ін. Зневоднення перешкоджає розвитку мікроорганізмів при тривалому зберіганні препарату.
3. Заливка. Для виготовлення тонких зрізів дослідні препарати заливають парафіном або заморожують.
4. Зрізи виготовляють за допомогою леза або мікротома. Для роботи на звичайному мікроскопі товщина зріза має бути 8-12 мкм. Тканину закріпляють між двома шматочками серцевини бузини. Лезо змочують рідиною (в якій зберігалася тканина), тримають горизонтально і рухають його до себе повільними рухами, які спрямовані ледь навкоси. Зріз з тканини, яка залита в середовище, можна зробити на мікротомі. Для світлового мікроскопу зрізи завтовшки в декілька мікрометрів можна зробити із залитої в парафін тканини за допомогою спеціального сталевого ножа. На ультрамікротомі виготовляють надтонкі зрізи (20-10 нм) для електронного мікроскопа. Для цього потрібний алмазний або скляний ніж. Зрізи для світлового мікроскопа можна виготовити без заливання матеріалу в середовище. Для цього використовується заморожуючий мікротом. Під час виготовлення замороженого зрізу зразок зберігається в замороженому (твердому) стані.
5. Фарбування. Більшість мікропрепаратів прозорі. Тому. Щоб побачити певну клітинну структуру, препарати фарбують. При фарбуванні парафінових зрізів парафін попередньо вилучають розчинником. Основні барвники, які використовуються в світловій мікроскопії - аніліновий синій в лактофенолі, борний кармін, еозин, барвник Фьольгена, гематоксилін та ін. Деякі барвники (в низьких концентраціях) не токсичні для живих тканин і тому можуть використовуватися для фарбування живих організмів. Їх називають вітальними барвниками, наприклад, метиленовий синій, нейтральний червоний та ін.
6. Закінчують виготовлення постійних препаратів з використанням канадського бальзаму, краплю якого наносять на забарвлений препарат на предметному склі. Зверху накривають покривним скельцем (слідкуючи, щоб в рідині не було повітря). Такі препарати зберігають необмежено довго.
Тимчасові препаратидля світлового мікроскопа можна виготовити досить швидко. Вони готуються для проведення швидких попередніх досліджень. Зріз свіжого матеріалу можна зробити власноруч за допомогою леза у воді (або в 70% спирті, який є фіксатором). Зрізи можна виготовити до фіксації або мацерації. Фіксація – закріплення певної структури або будови, мацерація – це роз’єднання клітин за допомогою розчину спеціальних речовин, що руйнують міжклітинні контакти. Барвниками тимчасових препаратів є метиленовий синій, що забарвлює ядра клітин в синій колір, розчин його забарвлює структури. Які містять крохмаль в синьо-чорний колір. Розчин Шульга (хлор-цинк-йод) забарвлює білки в жовтий колір, целюлозу – у фіолетовий.
Зріз розміщують на чистому предметному склі, що попередньо протирається спиртом для знежирення. На предметне скло наносять дкілька крапель барвника, потім препарат покривають покривним скельцем так, щоб запобігти попаданню повітря. Якщо препарат починає підсихати. Або дослідження триватиме більше 10 хв, то після фарбування препарат слід помістити в гліцерин.
Виконайте завдання:
Завдання 1.Підготовка мікроскопа до роботи. Організувати робоче місце з виконанням усіх правил роботи з мікроскопом, описаних вище. Знежирити (спиртом) предметне скло, нанести піпеткою краплю води, занурити в краплю за допомогою пінцета кілька волокон вати. Накрити препарат (під гострим кутом) покривним склом. Розглянути препарат під малим і великим збільшенням. Щоб переконатися, що зображення в мікроскопі перевернуте, розглянути на малому збільшенні друкований шифр або цифри. Охарактеризувати побачене.
Завдання 2.Приготуйте тимчасовий препарат епітелію шкіри жаби. Покладіть на предметний столик, розгляньте при малому і великому збільшенні мікроскопа. В полі зору побачите багатокутні клітини з тонкими оболонками. В центрі клітин розташованя ядра оклуглої форми. Замалюйте декілька клітин, позначте: ядро, оболонку, цитоплазму.
Завдання 3.Розглянути і проаналізувати електронні мікрофотографії різних клітин. Запротоколювати, яких компонентів не вистачає на проаналізованих електронних мікрофотографіях.
- Оформіть результати практичної роботи в альбомі.
ДОДАТОК 1.
Тестовий самоконтроль
1. Перерахувати елементи механічної частини мікроскопа:
а. штатив,
б. тубус,
в. окуляр,
г. револьвер,
д. колонка
2. Перерахувати елементи оптичної частини мікроскопа;
а. конденсор,
б. окуляр,
в. дзеркало,
г. револьвер
3. Перерахувати елементи освітлювальної частини мікроскопа;
а. дзеркало,
б. конденсор
в. діафрагма,
г. револьвер
4. Перерахувати засоби збільшення інтенсивності освітлення об'єкта;
а. опустити конденсор,
б. збільшити отвір діафрагми,
в. підняти конденсор,
г. зменшити отвір діафрагми
5. Назвати об'єктиви малого й великого збільшення, імерсійний об'єктива
а. х8,
б. хІ5,
в. х40,
г. х90,
д. х5.
ДОДАТОК 2.
ГРАФ ЛОГІЧНОЇ СТРУКТУРИ ДО ЗАНЯТТЯ
 |
Технологічна карта практичного заняття «Вступ до курсу медичної біології. Рівні організації живого. Оптичні системи в біологічних дослідженнях».
| № | Етапи | Часи за розкладом (хв.) | Засоби навчання | Обладнання |
| Перевірка присутніх. Корекція підготовки до заняття: а) усне опитування студентів б) необхідні пояснення викладача в) вхідний тестовий контроль знань | ||||
| Самостійна робота студентів: заповнення схем, таблиць. | Методичні розробки для студентів. | Мікроскопи „Біолам” | ||
| Підведення підсумків за всіма вищими роботами. Підпис протоколів. | Альбоми для практичних занять, журнал викладача. | |||
| Організація студентів на виконання самостійної роботи. Підготовка до наступного заняття. | Підручники . Методичні розробки за темою. | |||
| Всього |
ТЕСТОВИЙ КОНТРОЛЬ
Варіант І
Завдання І. Оприділіть основні частини мікроскопу
а. оптична;
б. механічна;
в. освітлювальна.
Завдання 2. Що, з перерахованого можна віднести до оптичної частини мікроскопу:
а. об'єктив;
б. конденсор;
в. окуляр.
Завдання 3. Що, з перерахованого можна віднести до механічної частини:
а. тубус;
б. револьвер;
в. дзеркало.
Завдання 4. Що, з перерахованого можна віднести до освітлювальної системи:
а. об'єктив;
б. конденсор;
в. дзеркало.
Завдання 5. Яким чином потрібно поставити препарат на предметний столик ?
а. покривним стеклом вверх;
б. покривним стеклом вниз;
в. байдуже.
Завдання 6. Для чого маркірується чорною смугою об'єктив на обоймі ?
а. зв'язано з водною імерсією;
б. зв'язано зфазоконтрастним приспособленням;
в. використанням для масляної імерсії.
Завдання 7. Для чого маркуються об'єктиви на обоймі білою смугою ?
а. зв'язано з водною імерсією;
б. зв'язано зфазоконтрастним приспособленням;
в. використанням для масляної імерсії.
Завдання 8. Зображення в мікроскопі е:
а. дійсне;
б. уявне;
в. зворотне.
Завдання 9. Чому дорівнює максимальне збільшення світлового мікроскопу ?
а. сумі збільшення об'єктиву та окуляра;
б. добутку збільшень об'єктиву та окуляра;
в. сумі оптичної сили окуляра, об'єктива та конденсора.
Завдання 10. Що являє собою площа поля зору ?
а. вона пропорціональна збільшенню;
б. вона обернено пропорціональна збільшенню;
в. не залежить від збільшення.
Варіант П
Завдання І. Де вказана кратність збільшення ?
а. на обоймі об'єктива;
б. на оправі лінзи окуляра;
в. на станині мікроскопа.
Завдання 2. Яка фокусна відстань об'єктиву малого збільшення ?
а. біля І мм;
б. біля І см;
в. декілька сантиметрів.
Завдання 3. Яка фокусна відстань об'єктиву великого збільшення ?
а. біля 2 мм;
б. біля І см;
в. декілька сантиметрів.
Завдання 4. Що потрібно зробити при переході на велике збільшення з малого ?
а. повернути макрогвинт на 1/4 обороту від себе;
б. перевести револьверне пристосування до фіксації об'єктива;
в. опустити об'єктив до відстані в 0,5-1 мм, дивлячись збоку.
Завдання 5. Які бувають об'єктиви для мікроскопів ?
а. сухі;
б. імерсійні;
в. фазово контрастні.
Завдання 6. Яким чином можна посилити освітлення препарату ?
а. підняттям конденсора;
б. відкриттям діафрагми;
в. установкою сферичної поверхні дзеркала.
Завдання 7. Яким чином можна посилити контраст зображення ?
а. опусканням конденсора;
б. відкриттям діафрагми;
в. закриттям діафрагми.
Завдання 8. Яким чином здійснюється грубе наведення на об'єкт ?
а. мікро гвинтом;
б. макро гвинтом;
в. гвинтом конденсора.
Завдання 9. Як здійснюється точна наводка на об'єкт ?
а. мікрогвинтом;
б. макрогвинтом;
в. гвинтом конденсора.
Завдання 10. Як здійснюється зміна збільшення ?
а. переведенням револьверного приспособлення;
б. зміною окулярів;
в. переміщенням тубусотримаза.