Культивирование вирусов. Методы.

Вирусы - строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбри­оны и культуры клеток.

Лабораторные животные:белые мыши (для вирусов гриппа, Коксаки), кролики (вирус бешенства). Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков забо­левания и изменений органов животного.

Куриные эмбрионы5-19-дневной инкубации пригодны для куль­тивирования большинства вирусов: Преимущества метода: стериль­ность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность полу­чения вирусов в больших количествах, простота техники работы. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по характеру колоний вируса на хорион-аллантоисной оболочке. В аллантоисной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты.

Культура клеток- это клетки из органа животного или человека, которые живут и размножаются вне организма в питательном раство­ре (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре кле­ток - один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Различают несколько типов культур.

1) первично-трипсинизированные, которые получают, обрабаты­вая трипсином исходную ткань, например, почки обезьян, или эмб­риональную ткань человека. Культура клеток используется однократно.

2) перевиваемые культуры клеток способны размножаться при мно­гократных посевах на свежие питательные среды. Они могут под­держиваться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет. Во многих лабораториях применяются перевиваемые куль­туры, полученные из раковой ткани человека: HeLa, ИЕр-2 и др.

3) полуперевиваемые культуры клеток - это, например, диплоидные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размно­жаться в течение 40-50 пассажей (пересевов), сохраняя исходный диплоидный набор хромосом.

Обнаружение вирусов в культуре клеток. Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вы­зывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД прояв­ляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании мно­гоядерных клеток.

ЦПД можно обнаружить по цветной пробе. Для этого используют клетки, помещенные в питательную среду с индикатором, например, метиловым красным. При размножении незараженных клеток образуются кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет на желтый. Если клетки заражены вирусом, происходит нарушение нормального метаболизма клеток, и цвет среды не меняется.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить и по образова­нию внутриклеточных включений.

Для подсчета количества вирионов используют метод бляшек. Клеточный монослой, покрытый тонким слоем агара, в плоском фла­коне, заражают вирусом и по количеству бляшек или "стерильных пя­тен" подсчитывают количество вирионов. Считается, что одна бляшка образуется при размножении одного вириона.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить также по реак­ции гемадсорбции. Это вариант реакции гемагглютинации. Эритроци­ты, внесенные в культуру клеток, адсорбируются на поверхности кле­ток, зараженных вирусом. Реакцию применяют, например, для обна­ружения вируса гриппа.

Бактериофагия.

Явление бактериофагии открыл и изучил французский микробио­лог д'Эррель. В 1917 г. он наблюдал лизис культуры бактерий дизентерии после внесения в нее фильтрата испражнений больного, выздоравлива­ющего от дизентерии. При многократных пассажах, то есть переносе из одной культуры в другую, фильтраты сохраняли свою лизирующую ак­тивность и даже усиливали ее. Ученый сделал из этого правильный вы­вод о том, что лизирующий агент - живой и при пассажах размножается в бактериях. Д'Эррель назвал этот агент бактериофагом (лат. phagos -пожирающий), а само явление лизиса - бактериофагией.

Позже было подтверждено, что бактериофаг - живой. Это вирус бак­терий, он размножается в бактериях, вызывая их лизис. Добавление бак­териофага в культуру бактерий на жидкой питательной среде вызывает просветление среды. На плотных питательных средах при посеве смеси бактерий и бактериофага на фоне сплошного роста бактерий появля­ются стерильные пятна или негативные колонии фагов.

Бактериофаг и специфичны, то есть лизируют определенные виды бактерий. Отсюда их названия: дизентерийный бактериофаг, стафи­лококковый бактериофаг. Обнаружены фаги не только бактерий, но и актиномицетов.

В практической медицине бактериофаги нашли применение как лечебные и профилактические средства.

Важное значение имеет то, что на примере бактериофагии были открыты и изучены многие проблемы общей вирусологиии и молекуляр­ной генетики.

Структура бактериофагов

Размеры бактериофагов колеблются от 20 нм до 200 нм. Как все вирусы, содержат ДНК, или РНК, и белковый капсид. Чаще всего встре­чаются и лучше изучены бактериофаги, имеющие форму сперматозои­да или головастика. Состоят они из головки, хвостового отростка, батальной пластинки с короткими шинами и хвостовыми нитями. Внутри головки располагается спи­рально скрученная пить ДНК, по­крытая белковым капсидом. Хвостовой отросток - что полый цилиндрический стержень, окру­женный сократительным чехлом. Базальная пластинка и нити осу­ществляют процесс адсорбции бактериофага на бактериальной клетке. Существуют бактериофаги,имеющие другое строе­ние: с короткими отростком, с отростком без сократительного чехла, без отростка, нитевидной формы.