Дослід з виявлення множинної стійкості до антибіотиків

Рисунок

Результат досліду, висновок

___________________________________________________ ______________________________________________________ _____________________________________________________ ______________________________________________________ _____________________________________________________ _____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________

Дослід трансдукції

Відомо, що передача матеріалу від одних бактерій до інших за допомогою бактеріофагів.

Для поставлення досліду трансдукції узяли:

1) помірний коліфаг, отриманий при опроміненні ультрафіолетовими променями культури донора лактозопозитивної культури E. coli lac+;

2) культуру реципієнта E. coli lac- (лактозонегативна);

3) середовище Ендо як селективне середовище з лактозою для виявлення лактозопозитивних рекомбінантів E. coli .

Методика поставлення досліду:

До 1 мл бульйонної культури реципієнта (E. coli lac-) додали 1 мл фага. Пробірку поставили на 40 хвилин у термостат. Потім зробили посів петлею на чашку Петрі з середовищем Ендо. Для контролю зробили посів з пробірки з культурою реципієнта.

Результати досліду, що очікуються: при завершеній специфічній трансдукції разом із помірним фагом у клітину реципієнта потрапляє і фрагмент хромосоми донорської культури з геном, що контролює синтез лактози. При перетворенні помірного фага в профаг разом із ним у хромосому реципієнта потрапляє і цей ген. Як бачимо з демонстрації, на середовищі Ендо поряд з материнськими лактозонегативними колоніями виросли і рекомбінанти у вигляді колоній червоного кольору.

Інкубація у термостаті 370С – 40 хвилин

Контроль

Висновок: ________________________________________________________________

Дослід кон’югації

Кон‘югація – перенесення генетичного матеріалу з клітини-донора у клітину-реципієнт через кон’югативний місточок.

Для досліду кон’югації узяли:

1) культуру-донора E. coli F+, Her, Pro+, Ura+, His+, Strs. Ця культура має фактор фертильності, що інтегрований у хромосому, і є прототрофною (здатна до синтезу проліну, урацилу, гістидину, але чутлива до стрептоміцину);

2) культуру-реципієнта E. coli F-, Pro-, Ura-, His-, Strr. Ця культура ауксотрофна стосовно проліну, урацилу, гістидину, але резистентна до стрептоміцину;

3) селективне середовище для виявлення рекомбінантів: синтетичне мінімальне середовище без амінокислот та із стрептоміцином у концентрації, що затримує ріст культури донора.

Методика поставлення досліду:

До 2 мл культури реципієнта додали 1 мл культури-донора. Посіви поставили у термостат при температурі 37⁰С на 10 хвилин. Після інкубації зробили посів з дослідної пробірки на селективне середовище і на це саме середовище на сектори посіяли для контролю культури-донора та реципієнта.

При кон‘югації з клітини донора в клітину реципієнта через протоплазматичний місточок переходить фрагмент хромосоми донора з генами, що контролюють синтез проліну, гістидину, урацилу. Утворюються рекомбінанти батьківських культур, що здатні до росту на мінімальному середовищі зі стрептоміцином (E. coli F-, Pro+, Ura+, His+, Strr).

2 мл культури реципієнта (F-)

Культура донора (F+)

Внести у 2 мл культури- реципієнта 1 мл культури- донора

Інкубація у термостаті 370С – 10 хвилин

F-

F+

Дослід

____________________

Висновок: ________________________________________________________________________________

Дослід трансформації

Трансформація – безпосередня передача генетичного матеріалу (фрагменту ДНК) донора реципієнтній клітині.

Для поставлення досліду трансформації стійкості до стрептоміцину взяли:

1) культуру-реципієнта – золотистий стафілокок, що чутливий до стрептоміцину;

2) ДНК, яка виділена з культури-донора, стафілокока, що стійкий до стрептоміцину;

3) селективне середовище – МПА зі стрептоміцином.

Методика поставлення досліду:

У стерильну пробірку налили 1 мл бульйонної культури-реципієнта та 1 мл розчину ДНК донора (1мкг). Суміш поставили у термостат на 40 хвилин при температурі 37⁰ С. Потім посіяли петлею на селективне середовище вміст з дослідної пробірки (після трансформації) та для контролю з пробірки з культурою реципієнта. ДНК донора, проникаючи в компетентні клітини реципієнта, включається в хромосому і передає ген стійкості до стрептоміцину, рекомбінант, які дають ріст колоній на МПА зі стрептоміцином. Якщо ж ДНК донора перед додаванням до культури реципієнта обробити дезоксирибонуклеазою, то трансформуючий фактор не передає спадкових властивостей донора. Трансформуються, як правило, окремі властивості, але іноді одночасно декілька ознак у зчепленому стані.

1 мл розчину ДНК донора

1 мл бульйонної культури-реципієнта

Інкубація у термостаті 370С – 40 хвилин

Дослід

Контроль

_____________________________________

Висновок: ________________________________________________

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Принцип методу ПЛР

В основу методу ПЛР покладено унікальну властивість НК (як РНК, так і ДНК) – здатність до саморепродукції, яка відтворюється штучно in vitro. При цьому синтезують суворо специфічні фрагменти НК. У зв’язку з цим перед тим як проводити ПЛР, необхідно дізнатися про нуклеотидну послідовність шуканої НК. Після цього синтезуються дві коротких ДНК-зонди або праймери, які комплементарні певним ділянкам НК-мішені. Праймер – найголовніший елемент у ПЛР, який забезпечує запуск і специфічність реакції. Таким чином, тест-система ПЛР складається із суміші НК зразка, що досліджується, праймера, дезоксирибонуклеотидів (набору нуклеотидтрифосфатів) і термолабільної ДНК-полімерази (ензиму термофільних бактерій Termus aquaticus). Вищезазначену реакційну суміш піддають повторним циклам нагрівання/охолодження для денатурації (при нагріванні) НК і гібридизації або при віджиги (при охолодженні) праймерів з метою синтезу (за допомогою ДНК-полімерази) нових НК.

Негативні зразки

Позитивні зразки

3. Детекція у агарозному гелі

1.Виділення ДНК

2.Ампліфікація

Позитивний контроль

Негативний контроль

Кількість циклів

Число копій фрагментів ДНК

Час

Температурний цикл

Малюнок 10 – Стадії ПЛР

Підпис чергового студента ______________

Підпис викладача ______________________

Практичне заняття ДАТА _______________

Тема. «НОРМАЛЬНА МІКРОФЛОРА ТІЛА ЛЮДИДИНИ. ДИСБАКТЕРІОЗ. ВЧЕННЯ ПРО ІНФЕКЦІЮ»

Питання для підготовки

1. 1. Поняття про нормальну мікрофлору тіла людини. Фази розвитку.

2. 2. Мікрофлора різних ділянок тіла людини.

3. 3. Фізіологічне значення нормальної мікрофлори.

4. Дисбактеріоз: причини виникнення, ступені розвитку, діагностика, лікування, профілактика.

5. Патогенність і вірулентність мікроорганізмів. Фактори вірулентності, методи визначення.

6. Роль макроорганізму, мікроорганізму, природних і соціальних умов життя та спадковості у виникненні та розвитку інфекційних захворювань.

7. Джерела, шляхи та механізми передачі інфекцій.

8. Патогенез інфекційних хвороб. Періоди розвитку інфекційного процесу.

9. Форми інфекції щодо збудника, патогенезу, способу зараження, клінічного прояву.

Список літератури

1. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія: підручник для студ. вищ. навч. закл. / за редакцією В.П. Широбокова. – Вінниця: Нова Книга, 2011. – С. 807 – 838.

2. Мікробіологія К. Д. П’яткін, Ю. С. Кривошеїн. – К.: Вища школа, 1992. – С. 84-89; 115-137.

2. Микробиология К. Д. Пяткин, Ю. С. Кривошеин. – М.: Медицина, 1981. – С. 8 – 93; 135-162.

3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология. – М.: МИА, 2001. – С. 136 – 150; 183 –201; 205 – 208.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – СПб, 2002. – С. 118 – 121; 124 – 135.

5. Поздеев О. К. Медициская микробиология / под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. – М.: ГЭОТАР, 2001. – С. 121 – 126; 140 – 154.

6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: ученик / под ред. А.А. Воробьева. – М.Медицинское информационное агетнство, 2004. – С. 87 – 92; 136 – 182.

7. Климнюк С.І., Ситник І.О., Твирко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: посібник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. – С. 94 – 111.

8. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. / К. Д. Пяткин, Н. С. Маркова, Н. Д. Трофимова. - М.: Медицина, 1969. – С. 105-106.

9. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии / под редакцией Л. Б. Борисова. – М.: Медицина, 1984. – С. 79-80; 100-101.

Практична робота 1. «Вивчення демонстрації»