Методы получения рекомбинантных ДНК с пом. рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз)

Для соед-я выделен-х фрагментов чужеродной ДНК и реципиентной ДНК используется набор рестриктаз. Основным типом рестриктаз при конструировании рекомб-х мол-л ДНК и при анализе стр-ры ДНК явл. Рестриктазы типа II. Они действуют на двухцепочечн. Мол-лы ДНК. Узнают специф-ие короткие нуклеотидные послед-ти и связыв-ся с ними, но в отличие от эндонуклеаз типа I и III они производят двухцепочечные разрезы по специф-им фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на некотор. расст-и от него.Ферменты типа II гидролизуют фосфодиэфирные связи м-ду 3’-гидрокс. группой и фосфатом, в рез-те образ-ся 5’-фосфатная гр. с одной стороны разрыва и 3’-гидрокс. гр. – с другой.

Широкоиспольз-я реестр-за II EcoRI (образует липкие концы, как и Bam HI, Hpa II, Tag I и т.д.) разрезает мол-лы ДНК в местах, где прис-т послед-ть (палиндром- послед-ти не мен-ся при чтении одной цепи справа налево, а др.- наобор.).

↓

5’-GAATTC-3’ 5’-G + 5’-AATTC-3’

3’-CTTAAG-5’ → 3’-CTTAA-5’ G-5’

↑

Сущ-т рест-зы II, котор. также узнают спец-ие палиндромные нуклеот. послед-ти, но разрезание просх-т в середине послед-ти, в рез. чего образ-ся фрагменты ДНК с тупыми двухцеп-ми концами. Известны ферменты типа II особой разновидности, узнающие специфические нуклеотидные последовательности, но гидролизующие фосфодиэфирные связи вне этих последовательностей. Кроме того, узнаваемая последовательность не является палиндромом.

Важным следствием образования ступенчатых разрывов при действии определенных рестриктаз является то, что полученные фрагменты двух разных ДНК могут соединяться с помощью «липких» концов в соответствии с правилом комплементарности. При этом видовые различия в структуре ДНК на процесс соединения фрагментов не влияют.

Так. образ, получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегментов ДНК из различных источников. В результате «отжига» эти сегменты соединяются с пом. наличия «липких» концов, но водородные связи, удерживающие их вместе, в обычн.усл. оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для прочного ковалентного сшивания фрагментов используют ДНК-лигазу, котор. катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Уникальная ДНК-лигаза фага Т4 (но не лигаза E. coli) способна соединять двухцепочечные молекулы ДНК с «тупыми» концами (хотя и с низкой эффективностью), катализируя образование фосфодиэфирных связей в обеих рекомбинируемых цепях.

Метод линкеров

В процессе конструирования рекомбинантных ДНК широкое применение находят короткие синтетические олигонуклеотиды. Для того, чтобы придать фрагменту нуклеиновой кислоты необходимые для встраивания в определенный участок векторной молекулы «липкие» концы, синтезируются так называемые линкеры – двухцепочечные олигонуклеотиды, которые содержат какую-либо последовательность, расщепляемую той или иной рестрикционной эндонуклеазой.

В большинстве случаев в качестве линкеров применяются самокомплементарные олигонуклеотиды длиной 8-10 нуклеотидных звеньев. Рис.1. Стр-ра линкера, содержащего последовательность, расщепляемую рестриктазой Eco RI.

Рис. 1 рис.2

При работе с рекомбинантными молекулами ДНК часто бывает необходимо заменить один тип «липких» концов на другой, когда «вырезание» встраиваемого фрагмента целесообразно осуществить с помощью одной рестриктазы, а удобный сайт разрезания векторной ДНК специфичен к другой рестриктазе. Для соединения таких молекул ДНК используются адапторные линкеры – частично двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие «липкие» концы, соответствующие двум разным рестрикционным эндонуклеазам (рис.2).

Третий тип линкеров, называемых дополняющими, позволяет перейти от «тупого» конца ДНК к «липкому», что существенно облегчает процесс рекомбинации.

Коннекторный метод

Коннекторная техника получения рекомбинантных ДНК заключается в том, что с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы к «тупым» 3′-концам одного фрагмента присоединяется гомодезоксиполинуклеотид, например, poly(dT) или poly(dC), а к «тупым» 3′-концам другого фрагмента - полинуклеотид, комплементарный используемому в первом случае, т.е. poly(dA) или poly(dG), соответственно.

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза катализирует синтез полидезоксирибонуклеотидов из dNTP с высвобождением неорганического пирофосфата. Подобно ДНК-полимеразам, этот фермент не способен инициировать синтез новой полимерной цепи и поэтому требует присутствия праймера со свободной концевой 3′-ОН-группой [9]. Однако в отличие от истинных ДНК-полимераз терминальная трансфераза не нуждается в матрице и вообще не способна к копированию нуклеотидных последовательностей. Продукт полимеризации по составу соответствует тому dNTP, который используется в качестве субстрата:

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не способна инициировать синтез новой полимерной цепи и поэтому требует присутствия праймера со свободной концевой 3′-ОН-группой. Но в отличие от истинных ДНК-полимераз терминальная трансфераза не нуждается в матрице и вообще не способна к копированию нуклеотидных последовательностей. Продукт полимеризации по составу соответствует тому dNTP, который используется в качестве субстрата. Если в реакции участвует dATP, то продуктом является полидезоксиадениловая кислота [poly(dA)], находящаяся на 3′-конце праймера, если же используется dGTP, то к праймеру оказывается присоединенной poly(dG).

Т.е, с пом. терминальной трансферазы к молекулам ДНК, имеющим «тупые» концы, можно присоединить концы «липкие». Иногда наиболее удобными сайтами расщепления в плазмиде могут оказаться участки узнавания для рестриктаз дающих «тупые» концы. Тогда к встраиваемому фрагменту ДНК под действием дезоксинуклеотидилтрансферазы присоед-т, например, poly(dT), а к концам разреза в плазмиде – poly(dA). При добавлении фрагментов друг к другу они в результате «отжига» комплексуются за счет образования комплементарных пар оснований между гомополинуклеотидами, принадлежащими разным фрагментам ДНК.

Пробелы, образующиеся из-за неравной длины poly(dT)- и poly(dA)-хвостов, а также вследствие действия 5′®3′-экзонуклеазы фага l, могут быть заполнены с помощью ДНК-полимеразы I, а бреши соединены ДНК-лигазой.